[發明專利]一種單細胞多巴胺受體亞型mRNA表達的巢式PCR檢測方法有效
| 申請號： | 201810957449.5 | 申請日： | 2018-08-22 |
| 公開（公告）號： | CN109182473B | 公開（公告）日： | 2021-09-24 |
| 發明（設計）人： | 田英芳;劉穎勛;刁志君;任維 | 申請（專利權）人： | 陜西師范大學 |
| 主分類號： | C12Q1/6858 | 分類號： | C12Q1/6858 |
| 代理公司： | 西安恒泰知識產權代理事務所 61216 | 代理人： | 李鄭建 |
| 地址： | 710062 *** | 國省代碼： | 陜西;61 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 單細胞 多巴胺 受體 mrna 表達 pcr 檢測 方法 | ||
1.一種單細胞多巴胺受體亞型mRNA表達的巢式PCR檢測方法，其特征在于，針對DAR的5種亞型基因Drd1、Drd2、Drd3、Drd4和Drd5分別設計兩輪PCR引物，通過巢式PCR進行兩輪擴增，對單個細胞內DAR的5種亞型基因表達進行檢測；在巢式PCR擴增的同時，通過對內參基因β-actin的檢測來判斷所抽提的核酸質量；
所述的DAR的5種亞型基因Drd1、Drd2、Drd3、Drd4和Drd5分別設計的巢式PCR兩輪擴增引物序列分別是：
Drd1第一輪PCR引物_F：TCCGATAGTTGGGCTCATCG；
Drd1第一輪PCR引物_R：CTGTTGCAATACCCCCACCC；
Drd1第二輪PCR引物_F：ATAGTTGGGCTCATCGCTGG
Drd1第二輪PCR引物_R：ACCGGGAAGGGGTTCTTCTA；
Drd2第一輪PCR引物_F：AACACACGCTACAGCTCCAA；
Drd2第一輪PCR引物_R：TCATGTCCTCAGGGTGGGTA；
Drd2第二輪PCR引物_F：CCCACTGCTCTTTGGACTCA；
Drd2第二輪PCR引物_R：GCTTGCGGAGAACGATGTAG；
Drd3第一輪PCR引物_F：TGGTTTCAACACAACAGGGGA；
Drd3第一輪PCR引物_R：CCATGGTGGGGCTTAAGGAG；
Drd3第二輪PCR引物_F：CACGGGACAAATGGAGCACA；
Drd3第二輪PCR引物_R：TGGCAGATGCTGTAGTAGCG；
Drd4第一輪PCR引物_F：CTGGGGTCCCACATCAAAGG；
Drd4第一輪PCR引物_R：GCATCCATGGCATCTACCCC；
Drd4第二輪PCR引物_F：CCTGGCCTTTGCTGATTTCC；
Drd4第二輪PCR引物_R：CCACCCAAGAGCAATGGATGA；
Drd5第一輪PCR引物_F：GCATCTACCGCATTGCACAG；
Drd5第一輪PCR引物_R：GACATAGGCAGCAGCGATCT；
Drd5第二輪PCR引物_F：GGCCAACTCCTCTCTCAACC；
Drd5第二輪PCR引物_R：TGTTTACCGTCTGCACGGG；
所述的對單個細胞內DAR的5種亞型基因表達進行檢測流程按以下步驟實施：
步驟一，單細胞捕獲及細胞內容物抽提；
步驟二，使用逆轉錄酶對抽提得到的細胞內容物直接進行反轉錄，制備cDNA；
步驟三，將制備的cDNA全部與DAR亞型基因Drd1、Drd2、Drd3、Drd4、Drd5，和內參基因β-actin第一輪擴增引物的混合物混合，進行多重PCR擴增；
步驟四，以第一輪擴增產物為模板，分別選取DAR亞型基因Drd1、Drd2、Drd3、Drd4、Drd5和內參基因β-actin的第二輪擴增引物，針對DAR的5種亞型及內參基因進行特異性PCR擴增；
步驟五，瓊脂糖凝膠電泳對擴增結果進行檢測，判斷多巴胺受體基因表達；
所述內參基因β-actin的擴增引物序列如下：
內參基因β-actin第一輪PCR引物_F：CTGAGCTGCGTTTTACACCC；
內參基因β-actin第一輪PCR引物_R：ACGCGACCATCCTCCTCTTA；
內參基因β-actin第二輪PCR引物_F：GACAGCAGTTGGTTGGAGCA；
內參基因β-actin第二輪PCR引物_R：TTTTGGGAGGGTGAGGGACT。
2.如權利要求1所述的方法，其特征在于，所述兩輪巢式PCR的反應條件為：
第一輪擴增：95℃，5min；再進行25個循環：即95℃：30s、55℃：1min、72℃：1min；最后72℃：10min；4℃保存；
第二輪擴增：95℃，5min；再進行30個循環：即95℃：30s、60℃：30s、72℃：30s；最后72℃：10min；12℃保存。
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