[發明專利]一種具有同時降低甘油三酯和膽固醇作用的干細胞及其制備方法和用途

在審

• 申請號: 201810955908.6
• 申請日: 2018-08-21
• 公開（公告）號: CN109182379A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 李程;周海波;丁秋蓉
• 申請（專利權）人: 杭州觀梓健康科技有限公司
• 主分類號: C12N15/864
• 分類號: C12N15/864;C12N5/10;A61K35/28;A61P9/00;A61P3/06
• 代理公司: 北京英創嘉友知識產權代理事務所(普通合伙) 11447
• 代理人: 耿超;王浩然

本公開提供了一種具有同時降低甘油三酯和膽固醇作用的干細胞的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：S1、將敲除載體包裝到AAV病毒中，形成待轉染AAV病毒顆粒；所述敲除載體的序列如SEQ ID NO.3所示；S2、將干細胞的懸液與所述待轉染的AAV病毒顆粒的懸液以進行轉染，得到轉染后的培養物；S3、將所述轉染后的培養物極限稀釋后進行單克隆化培養，并篩選出敲除了PCSK9基因和APOC3基因的單克隆細胞株。本公開還提供了如上所述的制備方法制備得到的干細胞及其在制備用于治療心血管疾病的藥物中的用途。通過上述技術方案，本公開提供了一種新的防治心血管疾病的方案，有效地降低了心血管疾病的發病率。

技術領域

本公開涉及醫藥生物技術領域，具體地，涉及一種具有同時降低甘油三酯和膽固醇作用的干細胞及其制備方法和用途。

背景技術

心血管疾病根據世界衛生組織的報道是全球的頭號死因。2008年有約1730萬人死于心血管疾病，預計到2030年，死于心血管疾病的人數將增至2330萬人。目前被證明防治心血管疾病發病的最有效的方法是降低血脂含量，尤其是降低低密度膽固醇(LDL-C)含量。他汀類藥物(statins)被有效的應用在心血管疾病的防治中，盡管如此，服用他汀類藥物并不能完全防治心血管疾病：病人只會降低30～40％的發病率，并且有部分病人群體對他汀類藥物治療方案沒有療效反應。因此，亟需尋找新的治療心血管疾病方案。

發明內容

本公開的目的是克服心血管疾病防治效果較差的缺陷，進一步降低心血管疾病的發病率。

為了實現上述目的，本公開提供了一種具有同時降低甘油三酯和膽固醇作用的干細胞的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：S1、將敲除載體包裝到AAV病毒中，形成待轉染AAV病毒顆粒；所述敲除載體的序列如SEQ ID NO.3所示；S2、將干細胞的懸液與所述待轉染的AAV病毒顆粒的懸液以進行4-30小時的轉染，得到轉染后的培養物；S3、將所述轉染后的培養物極限稀釋后進行單克隆化培養，并通過PCR及測序篩選出敲除了PCSK9基因和APOC3基因的單克隆細胞株。

另一方面，本公開還提供了一種干細胞，該干細胞為如上所述的制備方法制備得到的干細胞。

另一方面，本公開還提供了一種干細胞，該干細胞中的PCSK9基因和APOC3基因被定向敲除。

再一方面，本公開還提供了一種干細胞在制備用于治療心血管疾病的藥物中的用途，所述干細胞為如上所述的制備方法制備得到的干細胞或如上所述的干細胞。

通過上述技術方案，本發明在干細胞中將PCSK9基因和APOC3基因進行了雙敲除，雙敲除之后得到的干細胞通過注射的方式進入受試者后能夠定植在肝臟中，并且有效地降低血液中甘油三酯和膽固醇水平，由此可以產生對心血管疾病的防治效果，從而提供了一種新的防治心血管疾病的方案，有效地降低了心血管疾病的發病率。

本公開的其他特征和優點將在隨后的具體實施方式部分予以詳細說明。

具體實施方式

以下對本公開的具體實施方式進行詳細說明。應當理解的是，此處所描述的具體實施方式僅用于說明和解釋本公開，并不用于限制本公開。

本公開提供了一種具有同時降低甘油三酯和膽固醇作用的干細胞的制備方法，其特征在于，該方法包括如下步驟：S1、將敲除載體包裝到AAV病毒中，形成待轉染AAV病毒顆粒；所述敲除載體的序列如SEQ ID NO.3所示；S2、將干細胞的懸液與所述待轉染的AAV病毒顆粒的懸液以進行4-30小時的轉染，得到轉染后的培養物；S3、將所述轉染后的培養物極限稀釋后進行單克隆化培養，并通過PCR及測序篩選出敲除了PCSK9基因和APOC3基因的單克隆細胞株。

本發明通過選擇AAV病毒來將敲除載體轉染入細胞中，最終使得sgRNA、Cas9蛋白和敲除載體共同通過CRISPR基因編輯來使得PCSK9基因和APOC3基因得以共敲除。