[發(fā)明專利]基于二維液相色譜串聯(lián)質譜定性鑒定草莓柱頭蛋白的方法

有效

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• 申請日: 2018-08-21
• 公開（公告）號: CN108828126B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發(fā)明（設計）人: 裘劼人;王淑珍;柴偉國;阮松林;余紅;周厲萍;來文國
• 申請（專利權）人: 杭州市農業(yè)科學研究院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

本發(fā)明公開了一種基于二維液相色譜串聯(lián)質譜平臺定性鑒定草莓柱頭蛋白的方法，包括以下步驟：1)、草莓柱頭經提取純化，得蛋白粉；2)、蛋白定量和還原烷基化；3)、蛋白酶解；4)、第一維SCX強陽離子交換液相色譜分離肽段混合物；5)、第二維反向C18液相分離串聯(lián)Q Exactive質譜分析；6)、數(shù)據(jù)分析：質譜儀得到的原始文件經Maxquant搜庫鑒定，從而獲得蛋白和肽段信息列表。采用本發(fā)明的方法能對紅頰草莓柱頭蛋白進行定性鑒定，為構建紅頰草莓柱頭蛋白信息庫提供基礎。

技術領域

本發(fā)明涉及植物蛋白組學領域，提供一種利用強陽離子交換色譜和反向極性色譜二維分離，串聯(lián)Q Exactive質譜儀鑒定草莓(特別是紅頰草莓)柱頭蛋白的方法。

背景技術

草莓屬于薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)，由于其果實香甜的口感和豐富的營養(yǎng)元素而深受人們喜愛，隨著人們消費水平的提升，市場對新品種的需求也日益擴大。紅頰草莓是日本育成的優(yōu)質大果型品種(杭州市農業(yè)科學研究院2006年引進)，因其果形大而端正、口感酸甜適宜、果實硬度高，成為目前市場上最受歡迎的品種之一，但該品種對炭疽病、灰霉病等的抵抗能力較弱。將紅頰與抗病品種雜交是培育草莓新品種的一種思路，而研究柱頭可授性對雜交育種具有重要意義。目前檢測柱頭可授性最常用的方法是聯(lián)苯胺-過氧化氫法，此法能直觀有效地檢測柱頭可授性，但目前關于可授性變化的機理研究仍然很少。

蛋白質是生物體重要的物質組成成分，也是生命活動的直接執(zhí)行者，生物體所有的發(fā)育、代謝、應激等重要生理現(xiàn)象都有蛋白參與其中。蛋白組學從全蛋白水平上，通過分析蛋白表達水平、蛋白間互作關系等，揭示生命活動的本質機理。近年來隨著質譜儀器分辨率、掃描速度的提升，基于質譜平臺的蛋白組學分析技術也飛速發(fā)展。目前利用質譜技術的蛋白鑒定方法主要有3種：Bottom-up、Middle-down、Top-down。其中Bottom-up也稱鳥槍法是目前最主流的方法，該方法是將蛋白酶解成的肽段通過液相色譜分離、質譜儀鑒定、生物信息學工具拼裝最終得到蛋白信息。由于質譜單位時間內的檢測能力有限，肽段的預分離質量往往是決定蛋白鑒定量的關鍵因素。目前常用的肽段分離方法有3種，常規(guī)的反向C18柱一維液相分離、SCX強陽離子交換柱和常規(guī)反向C18柱二維液相分離、高PH反向C18柱和常規(guī)反向C18柱二維液相分離。

但僅用C18一維液相得到的肽段復雜度仍較高，分離度不夠，質譜鑒定到的蛋白量有限，通常Q Exactive單針蛋白鑒定量僅在2000-3500左右；SCX-C18串聯(lián)和高PH反向C18-常規(guī)反向C18串聯(lián)二維液相的分離效果受液相梯度影響較大，目前文獻報道的常用梯度對紅頰草莓柱頭蛋白肽段的分離效果不佳，為了提高鑒定量需要對分離梯度進行優(yōu)化。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種利用高效液相色譜串聯(lián)質譜定性鑒定草莓(特別是紅頰草莓)柱頭蛋白，為構建草莓柱頭蛋白信息庫提供基礎。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明提供一種基于二維液相色譜串聯(lián)質譜平臺定性鑒定草莓柱頭蛋白的方法，依次包括以下步驟：

1)、樣品準備和提取純化；

將小蕾期、中蕾期、大蕾期的草莓柱頭按照1:1:1的數(shù)量混合后作為樣品，經提取純化，得蛋白粉；

2)、蛋白定量和還原烷基化；

取裂解液溶解蛋白粉，得蛋白溶液(一般為：取400±40μL的裂解液溶解0.25±0.02g樣品對應所得的蛋白粉，得蛋白溶液)；

取含200μg蛋白的蛋白溶液，加入100mM NH₄HCO₃溶液(PH7.8)定容至100μL，再加入11μL 100mM的DTT(DL-Dithiothreitol，二硫蘇糖醇)溶液，混勻后放于37±1℃(金屬浴)反應1±0.1h；加入12μL 500mM的IAM(Iodoacetamide，碘乙酰胺)溶液，避光室溫反應30±2min；