[發明專利]基于二維液相色譜串聯質譜定性鑒定草莓柱頭蛋白的方法

有效

• 申請號: 201810955714.6
• 申請日: 2018-08-21
• 公開（公告）號: CN108828126B
• 公開（公告）日: 2020-06-02
• 發明（設計）人: 裘劼人;王淑珍;柴偉國;阮松林;余紅;周厲萍;來文國
• 申請（專利權）人: 杭州市農業科學研究院
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 杭州中成專利事務所有限公司 33212
• 代理人: 金祺

1.基于二維液相色譜串聯質譜定性鑒定草莓柱頭蛋白的方法，其特征是依次包括以下步驟：

1)、樣品準備和提取純化；

將小蕾期、中蕾期、大蕾期的草莓柱頭按照1:1:1的數量混合后作為樣品，經提取純化，得蛋白粉；

2)、蛋白定量和還原烷基化；

取裂解液溶解蛋白粉，得蛋白溶液；

取含200μg蛋白的蛋白溶液，加入100mM NH₄HCO₃溶液定容至100μL，再加入11μL 100mM的DTT溶液，混勻后放于37±1℃反應1±0.1h；加入12μL 500mM的IAM溶液，避光室溫反應30±2min；

3)、蛋白酶解；

將步驟2)所得的反應液進行超濾除雜，然后加入100mM NH₄HCO₃至總體積為100μL，加入4μg Trypsin，于37±1℃反應12～16h，從而實現酶解；

上述酶解完成后離心，在離心所得沉淀中加入100mM NH₄HCO₃ 100μL后重復離心一次，合并兩次離心所得液，即得肽段溶液；所述離心均為4±1℃12000±2000rpm離心15±2min；

肽段溶液中加入5％TFA水溶液至TFA終濃度為0.1～1％，除鹽后凍干，得凍干粉；所述％為體積％；

4)、第一維SCX強陽離子交換液相色譜分離肽段混合物；

SCX Buffer A：10mMKH₂PO₄，25％乙腈，pH 2.9；

SCX Buffer B：10mM KH₂PO₄，400mM KCl，25％乙腈,pH 2.9；

步驟3)所得的全部凍干粉用SCX Buffer A復溶，經BioBasic SCX柱梯度分離；分離梯度為：

0～5min，0％SCX Buffer B；

5～8min,0％～3％SCX Buffer B；

8～50min,3％～40％SCX Buffer B；

50～60min,40～100％SCX Buffer B；

60～65min,100％SCX Buffer B；

65-70min,100～0％SCX buffer B；

上述每個時間段的流動相的余量為SCX Buffer A；每個時間段內，SCX Buffer B的濃度均勻進行改變；洗脫流速為1ml/min；收集含有肽段的洗脫組分；除鹽后凍干，得到肽段粉末；

5)、第二維反向C18液相分離串聯Q Exactive質譜分析；

C18 Buffer A:0.1％甲酸水溶液；

C18 Buffer B:0.1％甲酸乙腈溶液；

步驟4)所得的肽段粉末進行以下的質譜分析：

用C18 Buffer A復溶，經Acclaim^TM PepMap^TM 100 C18液相色譜柱梯度在線分離后進QExactive質譜儀分析；分離梯度：0～3min,4～7％C18 Buffer B；3～103min,7～18％C18Buffer B；103～113min,18～35％C18 Buffer B；113～117min,35～75％C18 Buffer B,117～120min,75％C18 Buffer B；

上述每個時間段的流動相的余量為C18 Buffer A；每個時間段內，C18 Buffer B的濃度均勻進行改變；洗脫流速為1ml/min；

6)、數據分析：

質譜儀得到的原始文件經Maxquant搜庫鑒定，從而獲得蛋白和肽段信息列表。

2.根據權利要求1所述的基于二維液相色譜串聯質譜定性鑒定草莓柱頭蛋白的方法，其特征是：

所述步驟4)中，第10-18min每分鐘收集一管，18-50min每4分鐘收集一管，共計16管；每管均除鹽后凍干，因此得到16種肽段粉末；

所述步驟5)中，對步驟4)所得的16種肽段粉末均分別進行質譜分析；用20μL C18Buffer A對每種肽段粉末復溶。