[發明專利]一種快速檢測三種小麥根莖部病害的方法

在審

• 申請號: 201810950905.3
• 申請日: 2018-08-21
• 公開（公告）號: CN108893557A
• 公開（公告）日: 2018-11-27
• 發明（設計）人: 于金鳳;孫曉鳳;李鵬昌;張德珍;徐娜娜;劉愛新
• 申請（專利權）人: 山東農業大學
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/686;C12Q1/04
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 張紅軍

本發明屬于植物保護領域，提供了一種快速檢測三種小麥根莖部病害的方法。本發明在小麥苗期時對樣本進行多重PCR檢測，可以同時檢測小麥紋枯病菌、小麥根腐病菌和小麥莖基腐病菌，為小麥根莖部病害的早期診斷和有效防治提供技術支持。該PCR檢測方法具有特異、敏感、高效等優點，可應用于田間小麥樣本根莖部病害的快速檢測，具有較高的實際應用價值。

技術領域

本發明屬于植物保護領域，具體涉及一種快速檢測三種小麥根莖部病害的方法。

背景技術

小麥是一種重要的糧食作物，在中國的糧食安全和農業現代化發展中都占有重要地位。山東省是中國小麥第二大主產區，種植面積及產量均居全國前列。但是，近年來，小麥根莖部病害的流行，對山東省小麥的品質和產量造成了很大的損失。小麥紋枯病、小麥根腐病和小麥莖基腐病是三種重要的小麥根莖部病害。小麥紋枯病的主要病原是禾谷絲核菌（Rhizoctonia cerealis）。小麥根腐病的主要病原是麥根腐平臍蠕孢菌（Bipolaris sorokiniana）。小麥莖基腐病的病原是鐮孢屬（Fusarium spp.）真菌。這些病害的病原菌能在土壤中長期存活，在小麥苗期時即可侵染為害。一旦條件合適，病癥容易擴展導致蔓延成災。這些病害常常混合發生，早期癥狀相似，不易區分，防治較為困難。因此，建立快速檢測技術對于小麥根莖部病害的防治具有重要的指導意義。

分子生物學的發展和 PCR 技術的誕生為植物病原菌的檢測、鑒定和量化提供了新的方法和手段。多重PCR(multiplex PCR)是指在同一反應體系中加入兩對或兩對以上引物，當體系中存在與各引物對特異互補的模板時,就會出現相應的條帶。這一概念是Chamberlian于1988年首先提出。多重PCR具有快速、特異、靈敏、低成本等優點，現已被廣泛應用于植物病原菌的檢測與鑒別。陳思等利用多重PCR技術，在同一體系中對小麥稈銹病、小麥葉銹病和小麥白粉病進行了準確地區分；高士剛等建立了同步檢測黃瓜靶斑病原菌、黃瓜炭疽病菌和黃瓜細菌性角斑病菌的多重PCR方法。

目前，雖然已經有相關文獻報道過這三種病害（小麥紋枯病、小麥根腐病和小麥莖基腐病）的同時檢測，但本發明所采用的引物都是自主設計的，并利用正交設計的方法建立和優化了檢測體系，能同時檢測以上三種小麥根莖部病害，具有重要的實踐意義。

發明內容

本發明提供了一種快速檢測三種小麥根莖部病害的方法，利用多重PCR技術可以在小麥苗期實現快速檢測。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明提供了一種快速檢測三種小麥根莖部病害的方法，包括以下步驟：

ST1 取樣，田間取苗期植株；

ST2 提取基因組DNA，采用改良的CTAB法提取基因組DNA；

ST3 進行多重 PCR 反應，添加根據禾谷絲核菌rDNA-ITS、麥根腐平臍蠕孢菌rDNA-ITS、鐮孢菌（Fusarium spp.）EF-1α基因序列設計的引物各一對，添加Taq DNA聚合酶、dNTP，進行多重 PCR 反應，PCR擴增程序為：預變性 94℃，5 min；94℃變性30s，53.0-63℃時退火30s，72℃延伸 1min，35個循環，72℃延伸 5 min；

ST4 進行DNA電泳并分析。

優選的，步驟ST3所述設計的引物為SEQ ID NO.1-SEQ ID NO.6 。

優選的，步驟ST3所述退火30s，溫度為55℃。

優選的，步驟ST3中WKF-S18/WKR-S8濃度為0.24-0.48μmol/L。