[發(fā)明專利]一種生產(chǎn)L-木糖的重組變形假單胞菌及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810948746.3
• 申請(qǐng)日: 2018-08-20
• 公開（公告）號(hào): CN109055292B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陸茜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海凌凱醫(yī)藥科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/78;C12P19/02;C12R1/38
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種生產(chǎn)L?木糖的重組變形假單胞菌及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明將合成的2?酮基葡萄糖酸還原酶基因和來源于Corynebaterium ATCC 31090的2,5?二酮基葡萄糖酸還原酶基因和Saccharomyces cerevisiae的丙酮酸脫羧酶基因，以雙質(zhì)粒系統(tǒng)在宿主變形假單胞菌中成功表達(dá)，獲得的基因工程菌株在搖瓶上發(fā)酵56h，L?木糖的產(chǎn)量可達(dá)16.2g/L，轉(zhuǎn)化率達(dá)到了20.3％，在3L和15L發(fā)酵罐上分別發(fā)酵48h和44h，L?木糖的產(chǎn)量分別可達(dá)37.6g/L和45.8g/L，葡萄糖轉(zhuǎn)化率分別為47.0％和57.3％。該方法原料成本低，對(duì)環(huán)境無污染，且操作簡(jiǎn)單，具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種生產(chǎn)L-木糖的重組變形假單胞菌及其應(yīng)用，屬于生物工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

木糖是一種五碳糖，L-木糖主要存在于植物和動(dòng)物體內(nèi)。木糖屬于無熱量甜味劑，廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化工等領(lǐng)域。食用木糖能改善人體的微生物環(huán)境，提高機(jī)體免疫能力，是糖尿病人理想的甜味劑。

目前制備木糖均采用酸法提取，酸法生產(chǎn)木糖多采用硫酸進(jìn)行水解，但酸法生產(chǎn)木糖有如下缺點(diǎn)：①生產(chǎn)過程中采用大量硫酸，硫酸使原料中的纖維素和半纖維素及其它糖類物質(zhì)水解，產(chǎn)生多種副產(chǎn)物，影響后提取工藝和產(chǎn)品質(zhì)量。②酸法提取木糖由于生產(chǎn)過程中加入大量強(qiáng)酸強(qiáng)堿液體，生產(chǎn)過程中產(chǎn)生大量生產(chǎn)廢液，對(duì)環(huán)境造成了巨大污染。③由于酸水解的糖液雜質(zhì)多，使得后處理效率低，化工程序多，對(duì)設(shè)備要求高，增加環(huán)保成本。

目前，L-木糖的生產(chǎn)主要是由化學(xué)合成的方法，存在上述的不利因素。L-木糖也可由L-木酮糖轉(zhuǎn)化生成，但是L-木酮糖屬于稀有糖，價(jià)格較高，不宜作為生產(chǎn)L-木糖的原料。

變形假單胞菌屬于假單胞菌屬，為革蘭氏陰性桿菌。假單胞菌中葡萄糖的代謝是通過ED途徑(Entner-Doudoroff pathway)完成的，在好氧條件下，葡萄糖在周質(zhì)空間被氧化為葡萄糖酸，研究表明，在假單胞菌中大多數(shù)由葡萄糖產(chǎn)生的葡萄糖酸(約90％)被轉(zhuǎn)化為2-酮基葡萄糖酸(2KGA)。目前，變形假單胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是國內(nèi)2KGA生產(chǎn)的主要工業(yè)用菌。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種生產(chǎn)L-木糖的重組菌，是以變形假單胞菌為宿主，利用雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)2-酮基葡萄糖酸脫氫酶基因、2,5-二酮基葡萄糖酸還原酶基因和丙酮酸脫羧酶基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述雙質(zhì)粒表達(dá)系統(tǒng)包括pME6032質(zhì)粒和pBBR1MCS-2質(zhì)粒。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述pME6032質(zhì)粒用于表達(dá)2-酮基葡萄糖酸脫氫酶基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述pBBR1MCS-2質(zhì)粒用于表達(dá)2,5-二酮基葡萄糖酸還原酶基因和丙酮酸脫羧酶基因。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述2-酮基葡萄糖酸脫氫酶基因2GADH由三個(gè)亞基組成，分別表示為2GADH-1，2GADH-2，2GADH-3，其序列分別以SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，以pME6032質(zhì)粒為載體，在變形假單胞菌中表達(dá)SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3所示基因2GADH的三個(gè)亞基。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述2,5-二酮基葡萄糖酸還原酶基因2,5DKG來自Corynebaterium ATCC 31090。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述丙酮酸脫羧酶基因PDC來自Saccharomycescerevisiae。