[發明專利]一種生產L-木糖的重組變形假單胞菌及其應用

有效

• 申請號: 201810948746.3
• 申請日: 2018-08-20
• 公開（公告）號: CN109055292B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 陸茜
• 申請（專利權）人: 上海凌凱醫藥科技有限公司
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/78;C12P19/02;C12R1/38
• 代理公司: 哈爾濱市陽光惠遠知識產權代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

1.一種生產L-木糖的重組菌，其特征在于，所述重組菌是以變形假單胞菌為宿主，以雙質粒表達系統表達2-酮基葡萄糖酸脫氫酶基因、2,5-二酮基葡萄糖酸還原酶基因和丙酮酸脫羧酶基因，所述雙質粒表達系統包括pME6032質粒和pBBR1MCS-2質粒；所述pME6032質粒用于表達2-酮基葡萄糖酸脫氫酶基因，所述pBBR1MCS-2質粒用于表達2,5-二酮基葡萄糖酸還原酶基因和丙酮酸脫羧酶基因；所述2-酮基葡萄糖酸脫氫酶2GADH由三個亞基組成，分別如序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示；所述2,5-二酮基葡萄糖酸還原酶基因2,5DKG來自Corynebaterium ATCC 31090；所述丙酮酸脫羧酶基因PDC來自Saccharomyces cerevisiae；所述變形假單胞菌宿主為Pseudomonas plecoglossicidaCGMCC 7150。

2.權利要求1所述的一種生產L-木糖的重組菌的構建方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示基因同時與載體pME6032質粒連接形成重組質粒pME6032-2gadh；

(2)將上述重組質粒pME6032-2gadh轉化至變形假單胞菌中得到重組變形假單胞菌；

(3)分別擴增2,5-二酮基葡萄糖酸還原酶基因和丙酮酸脫羧酶基因，將二者序列同時與載體pBBR1MCS-2連接形成重組質粒pBBR1MCS-2-25dkg-pdc；

(4)將步驟(3)所得的重組質粒pBBR1MCS-2-25dkg-pdc轉化至含有重組質粒pME6032-2gadh的變形假單胞菌中得到含有雙質粒的重組菌。

3.應用權利要求1所述的重組菌生產L-木糖的方法，其特征在于，將所述重組菌在發酵培養基中培養至OD₆₅₀為0.6-0.8，加入IPTG誘導2-酮基葡萄糖酸脫氫酶基因、2,5-二酮基葡萄糖酸還原酶基因和丙酮酸脫羧酶基因的表達，以葡萄糖為底物合成L-木糖。

4.根據權利要求3所述的方法，其特征在于，所述發酵培養基：葡萄糖75.0-85.0g/L，玉米漿3.0-4.0g/L，尿素1.5-2.5g/L，KH₂PO₄ 1.5-2.5g/L，MgSO₄·7H₂O 0.4-0.6g/L，CaCO₃9.0-11.0g/L，pH值6.8。

5.根據權利要求3或4所述的方法，其特征在于，所述重組菌在發酵前需在種子培養基上培養，所述種子培養基：葡萄糖14.0-15.0g/L，玉米漿3.5-4.0g/L，尿素1.5-2.5g/L，KH₂PO₄1.5-2.5g/L，MgS04·7H₂O 0.4-0.6g/L，CaCO₃ 0.8-1.2g/L，pH值7.0。

6.權利要求1所述的一種生產L-木糖的重組菌在食品、醫藥、化工領域的應用。