[發明專利]腸炎沙門菌cirA基因缺失的應用

有效

• 申請號: 201810948687.X
• 申請日: 2018-08-20
• 公開（公告）號: CN108949663B
• 公開（公告）日: 2021-08-03
• 發明（設計）人: 張志強;史秋梅;李永慧;吳同壘;蘇碩青
• 申請（專利權）人: 河北科技師范學院
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/90;A61K39/112;A61P31/04;C12R1/42
• 代理公司: 北京慕達星云知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 11465
• 代理人: 李冉

1.腸炎沙門菌cirA基因缺失在制備降低腸炎沙門菌毒力藥物中的應用。

2.腸炎沙門菌cirA基因缺失在制備腸炎沙門菌疫苗中的應用。

3.根據權利要求2所述的腸炎沙門菌cirA基因缺失在制備腸炎沙門菌疫苗中的應用，其特征在于，所述腸炎沙門菌cirA基因缺失株的構建方法如下：

(1)利用引物P1和P2，經PCR擴增，構建cirA基因敲除打靶片段；所述引物序列為：

P1：5’-AGCAAGATTTACAGCGCAGGCCCGTGCAAAACCTGAAAGATGTCCTGAAAGAGGTGCCGGTGTAGGCTGGAGCTGCTTCG-3’，SEQ ID NO：1；

P2：5’-TGATACGTAGAATGACCAGTCTTCGAGCTGCGCCGGTTTCCAGTCCAGCGTACCGTTCGATGGGAATTAGCCATGGTCC-3’，SEQ ID NO：2；

(2)將質粒pKD46轉入C50336感受態細胞，獲得C50336/pKD46陽性菌株，并將所述陽性菌株C50336/pKD46制備成感受態細胞；

(3)將cirA基因敲除打靶片段電轉化進入C50336/pKD46感受態細胞，獲得陽性重組子C50336cirA::cat；

(4)利用陽性C50336cirA::cat菌株制備感受態細胞，電轉化導入pCP20質粒，消除氯霉素抗性標記，得到目的菌株C50336ΔcirA；

(5)對目的菌株C50336ΔcirA進行PCR驗證。

4.根據權利要求3所述的腸炎沙門菌cirA基因缺失在制備腸炎沙門菌疫苗中的應用，其特征在于，步驟(1)所述PCR擴增的反應體系共50μl，包括引物P1、P2各1μl，dNTPs 2.5μl，rTaq酶1μl，10×buffer 5μl，100倍稀釋的pKD3質粒1μl，其余用水補足；反應程序為94℃預變性5min，94℃45s，54℃30s，72℃60s，共25個循環，72℃終延伸10min。

5.根據權利要求3所述的腸炎沙門菌cirA基因缺失在制備腸炎沙門菌疫苗中的應用，其特征在于，步驟(3)所述電轉化的條件為：電壓1.8KV，脈沖25μF，電阻200Ω。