[發明專利]一種抗黃瓜花葉病毒的弱毒疫苗、制備方法及其應用

有效

• 申請號: 201810948244.0
• 申請日: 2018-08-20
• 公開（公告）號: CN110885797B
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 李向東;劉錦;李現道;耿超;田延平;劉茜;郭兆奎;萬秀清;喬嬋;李若
• 申請（專利權）人: 山東農業大學;中國煙草總公司黑龍江省公司牡丹江煙草科學研究所
• 主分類號: C12N7/01
• 分類號: C12N7/01;C12N1/21;A01N63/40;A01P1/00;C12R1/94
• 代理公司: 北京元中知識產權代理有限責任公司 11223
• 代理人: 另婧

本發明涉及植物抗病毒基因工程領域，公開了一種抗黃瓜花葉病毒的弱毒疫苗、制備方法及其應用。抗黃瓜花葉病毒的弱毒疫苗以TVBMV弱毒突變體為基礎，TVBMV弱毒突變體中嵌入了可誘導對黃瓜花葉病毒產生交叉保護的有效基因片段，所述的有效基因片段包括黃瓜花葉病毒的2b基因。所述的2b基因的核苷酸序列如Seq ID No.19所示。本發明的抗黃瓜花葉病毒的弱毒疫苗作用穩定，可以起到有效的交叉保護作用，顯著減輕植物受黃瓜花葉病毒強毒株系感染后的傷害，延遲植物發病，大大減少損失。

技術領域

本發明屬于植物抗病毒基因工程領域，具體地說，涉及一種抗黃瓜花葉病毒的弱毒疫苗、制備方法及其應用。

背景技術

病毒病是作物上的重要病害，給農業生產造成巨大損失。由于作物病毒病種類多，傳播途徑復雜，生產上沒有免疫或高抗病毒病的品種，市場上又沒有對病毒病特效的藥劑，因而病毒病的防治非常困難。

煙草病毒病一直是制約我國煙葉生產的重要因素。目前生產上的煙草主栽品種對病毒病的抗性都不理想，煙草病毒病的防治主要依賴農業防治和化學防治。但生產中沒有針對病毒病的特效藥劑，通過殺滅傳毒昆蟲來防治煙草病毒病的效果很差，而且農藥的大量應用也不符合煙葉生產可持續發展的要求。利用弱毒株系保護植物免受強毒株系的侵染和危害(交叉保護)是防治病毒病非常有效的手段，在許多作物病毒病的防治中取得了成功。最近幾年，交叉保護受到了越來越多的關注。交叉保護是指植株受弱毒株系侵染后，免受后繼的病毒強毒株系侵染的現象，已經在許多作物病毒病的防治中取得了成功。而限制交叉保護廣泛應用的關鍵因素是一是目前可用的弱毒株系種類不多，應用不方便，二是已發現的弱毒株系都是自然存在或人工誘變產生的，可能只在個別甚至是一個氨基酸位點發生了突變。這些弱毒株系或突變體在用于防治病毒病時有突變為強毒株系的風險。

黃瓜花葉病毒(CMV)是一種非常嚴重的病毒病害，病毒可以到達除生長點以外的任何部位。黃瓜花葉病毒是寄主范圍最多、分布最廣、最具經濟重要性的植物病毒之一。全世界所有煙草種植區均有該病毒的分布和危害。在農業生產中，黃瓜花葉病毒會對煙草、辣椒、馬鈴薯等茄科作物造成嚴重的損失。因此，急需能夠起到有效交叉保護作用的穩定的弱毒疫苗來防治黃瓜花葉病毒。

有鑒于此特提出本發明。

發明內容

本發明要解決的技術問題在于克服現有技術的不足，提供一種抗黃瓜花葉病毒的弱毒疫苗、制備方法及其應用。本發明的抗黃瓜花葉病毒的弱毒疫苗作用穩定，可以起到有效的交叉保護作用，顯著減輕植物受黃瓜花葉病毒強毒株系感染后的傷害，延遲植物發病，大大減少損失。

為解決上述技術問題，本發明采用技術方案的基本構思是：

本發明的第一目的是提供一種抗黃瓜花葉病毒的弱毒疫苗，弱毒疫苗以TVBMV弱毒突變體為基礎，TVBMV弱毒突變體中嵌入了可誘導對黃瓜花葉病毒產生交叉保護的有效基因片段，所述的有效基因片段包括黃瓜花葉病毒的2b基因。

本發明以自主構建的煙草脈帶花葉病毒(Tobacco vein banding mosaic virus，TVBMV)突變體為基礎，該突變體在接種植物后不會引起可見癥狀，不會由蚜蟲傳播，使用安全。通過RT-PCR、酶切連接技術將黃瓜花葉病毒(CMV)的不同基因片段連入TVBMV突變體獲得嵌合體病毒，也就是弱毒疫苗。然后將弱毒疫苗接種植物，接種15天后再用黃瓜花葉病毒(CMV)強毒株系侵染植物。結果意外地發現CMV的2b基因片段可延遲煙草發病，減輕植株感染病毒病后的損失。

進一步的方案，所述的2b基因的核苷酸序列如Seq ID No.19所示。

進一步的方案，所述的TVBMV弱毒突變體包括煙草脈帶花葉病毒HN39的基因組，基因組的5’末端連接有35S啟動子；且基因組的HC-Pro氨基酸序列中含有突變，至少第52位的精氨酸突變為谷氨酸。