[發(fā)明專利]一種植物病毒弱毒疫苗組合物、弱毒疫苗保存方法及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810948204.6
• 申請(qǐng)日: 2018-08-20
• 公開（公告）號(hào): CN110856493B
• 公開（公告）日: 2022-02-25
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 劉永中;李向東;姜瀚林;郭兆奎;耿超;田延平;萬秀清;李現(xiàn)道;喬嬋;李若
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 中國煙草總公司黑龍江省公司牡丹江煙草科學(xué)研究所;山東農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N7/04
• 分類號(hào): C12N7/04;C12R1/01
• 代理公司: 北京元中知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限責(zé)任公司 11223
• 代理人: 另婧

1.一種植物病毒弱毒疫苗組合物，其特征在于，植物病毒弱毒疫苗組合物包括攜帶植物病毒弱毒疫苗的發(fā)酵菌體、輕質(zhì)碳酸鈣、黃腐酸和黃原膠；

所述的植物病毒弱毒疫苗以TVBMV弱毒突變體為載體，TVBMV弱毒突變體中嵌入了可誘導(dǎo)對(duì)馬鈴薯X病毒、和/或馬鈴薯Y病毒、和/或黃瓜花葉病毒、和/或煙草花葉病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)的有效基因片段；

所述的TVBMV弱毒突變體由pCamTVBMV在HC-Pro 序列中進(jìn)行四個(gè)位點(diǎn)突變獲得，所述的位點(diǎn)突變?yōu)椋?2位的精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔?98位的天冬氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔坏?50位的異亮氨酸突變?yōu)樘於彼幔?51位的谷氨酰胺突變?yōu)楣劝彼幔?/p>

可誘導(dǎo)對(duì)馬鈴薯X病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)的有效基因片段包括馬鈴薯X病毒的RdRp基因，其核苷酸序列如Seq ID No.13、或Seq ID No.14所示、或Seq ID No.15所示；

可誘導(dǎo)對(duì)馬鈴薯Y病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)的有效基因片段包括PVY1片段和PVY2片段，PVY1片段的核苷酸序列如Seq ID No.20所示，PVY2片段的核苷酸序列如Seq ID No.21所示；

可誘導(dǎo)對(duì)黃瓜花葉病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)的有效基因片段包括黃瓜花葉病毒的2b基因，2b基因的核苷酸序列如Seq ID No.24所示；

可誘導(dǎo)對(duì)煙草花葉病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)的有效基因片段包括煙草花葉病毒的TMV3片段，TMV3片段的核苷酸序列如Seq ID No.27所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物病毒弱毒疫苗組合物，其特征在于，攜帶植物病毒弱毒疫苗的發(fā)酵菌體與輕質(zhì)碳酸鈣的體積比為1:1。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物病毒弱毒疫苗組合物，其特征在于，所述的組合物中黃腐酸和黃原膠的質(zhì)量比為1:1。

4.根據(jù)權(quán)利要求1-3任一所述的一種植物病毒弱毒疫苗組合物，其特征在于，所述的黃腐酸和黃原膠的添加量與發(fā)酵菌體和輕質(zhì)碳酸鈣混合物的關(guān)系為：每10ml發(fā)酵菌體和輕質(zhì)碳酸鈣混合物中加入50mg黃腐酸和50mg黃原膠。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種植物病毒弱毒疫苗組合物，其特征在于，所述的發(fā)酵菌體包括農(nóng)桿菌。

6.一種延長植物病毒弱毒疫苗保存時(shí)間的方法，其特征在于，包括：

（1）攜帶弱毒疫苗的發(fā)酵菌體經(jīng)過離心濃縮后，加入輕質(zhì)碳酸鈣粉制成混合物粉劑；

（2）在混合物粉劑中加入黃腐酸和黃原膠，制成植物病毒弱毒疫苗組合物，延長保存期；

所述的弱毒疫苗包括以TVBMV弱毒突變體為載體，TVBMV弱毒突變體中嵌入了可誘導(dǎo)對(duì)馬鈴薯X病毒、和/或馬鈴薯Y病毒、和/或黃瓜花葉病毒、和/或煙草花葉病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)的有效基因片段；

所述的TVBMV弱毒突變體由pCamTVBMV在HC-Pro 序列中進(jìn)行四個(gè)位點(diǎn)突變獲得，所述的位點(diǎn)突變?yōu)椋?2位的精氨酸突變?yōu)楣劝彼幔?98位的天冬氨酸突變?yōu)橘嚢彼幔坏?50位的異亮氨酸突變?yōu)樘於彼幔?51位的谷氨酰胺突變?yōu)楣劝彼幔?/p>

可誘導(dǎo)對(duì)馬鈴薯X病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)的有效基因片段包括馬鈴薯X病毒的RdRp基因，其核苷酸序列如Seq ID No.13、或Seq ID No.14所示、或Seq ID No.15所示；

可誘導(dǎo)對(duì)馬鈴薯Y病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)的有效基因片段包括PVY1片段和PVY2片段，PVY1片段的核苷酸序列如Seq ID No.20所示，PVY2片段的核苷酸序列如Seq ID No.21所示；

可誘導(dǎo)對(duì)黃瓜花葉病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)的有效基因片段包括黃瓜花葉病毒的2b基因，2b基因的核苷酸序列如Seq ID No.24所示；

可誘導(dǎo)對(duì)煙草花葉病毒產(chǎn)生交叉保護(hù)的有效基因片段包括煙草花葉病毒的TMV3片段，TMV3片段的核苷酸序列如Seq ID No.27所示。

7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的延長植物病毒弱毒疫苗保存時(shí)間的方法，其特征在于，攜帶植物病毒弱毒疫苗的發(fā)酵菌體與輕質(zhì)碳酸鈣的體積比為1:1。