[發明專利]一種斑馬魚心臟特異表達模型的構建方法及相關載體

有效

• 申請號: 201810941364.8
• 申請日: 2018-08-17
• 公開（公告）號: CN108949756B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 崔恒宓;薛松磊;沈暉;孫振;歐陽娟;徐慧
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷麗

1.一種斑馬魚心臟特異表達模型的構建方法，其特征在于，包括：

（1）構建同源重組載體，獲得插入片段；所述插入片段包括斑馬魚心臟特異表達的啟動子、融合LoxP位點序列的左側同源臂和右側同源臂、內部核糖體進入位點、報告基因、轉錄終止信號片段以及位于所述啟動子和報告基因之間的多克隆位點，所述的左側同源臂和右側同源臂之間依次設有以下元件：斑馬魚心臟特異表達的啟動子、多克隆位點、內部核糖體進入位點、報告基因和轉錄終止信號片段；其中，所述啟動子位于報告基因上游，所述終止信號位于報告基因下游，左側同源臂位于啟動子上游，右側同源臂位于終止信號下游，同源臂的內側含有LoxP序列；左側同源臂和右側同源臂靶向斑馬魚色素基因；所述啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示；所述的報告基因為熒光報告基因EGFP，序列為SEQ IDNO.22；所述的內部核糖體進入位點為IRES2，序列為SEQ ID NO.28，所述的轉錄終止信號片段為SV40 polyA；所述斑馬魚色素基因為斑馬魚Tyrosinase基因，靶點序列為SEQ IDNO.1；所述左側同源臂的序列為SEQ ID NO.2，所述右側同源臂的序列為SEQ ID NO.3；

（2）設計針對同源臂靶向基因的特異性靶點，合成相應的sgRNA，合成Cas9-mRNA；

（3）將所獲得sgRNA、Cas9-mRNA和插入片段轉入斑馬魚受精卵中，篩選轉基因斑馬魚；步驟（3）中，在斑馬魚發育至24hpf早期心臟搏動開始，即可以篩選獲得心臟表達EGFP基因的陽性個體，24hpf后由于色素基因被阻斷表達，陽性個體無色素沉積，利于心臟在體觀察檢測；在斑馬魚成年后，篩選實驗需求的特定心臟表型，通過Cre酶特異性將LoxP位點之間引入的外源序列刪除，恢復色素基因的表達，達到調控插入基因表達的目的，恢復無外源基因插入的斑馬魚群體。