[發明專利]一種斑馬魚心臟特異表達模型的構建方法及相關載體

有效

• 申請號: 201810941364.8
• 申請日: 2018-08-17
• 公開（公告）號: CN108949756B
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 崔恒宓;薛松磊;沈暉;孫振;歐陽娟;徐慧
• 申請（專利權）人: 揚州大學
• 主分類號: C12N15/11
• 分類號: C12N15/11;C12N15/63;C12N15/90;A01K67/027
• 代理公司: 南京蘇高專利商標事務所(普通合伙) 32204
• 代理人: 王艷麗

本發明公開了一種斑馬魚心臟特異表達模型的構建方法及相關載體。同源重組載體，包括插入原始載體的插入片段，插入片段包括斑馬魚心臟特異表達的啟動子、融合LoxP位點序列的左側同源臂和右側同源臂、多克隆位點、內部核糖體進入位點、報告基因、轉錄終止信號片段；其中，所述啟動子位于報告基因上游，所述終止信號位于報告基因下游，左側同源臂位于啟動子上游，右側同源臂位于終止信號下游，同源臂的內側含有LoxP序列，多克隆位點位于所述啟動子和報告基因之間；左側同源臂和右側同源臂靶向斑馬魚色素基因。還提供了斑馬魚心臟特異表達模型的構建方法，本發明可用于快速建立斑馬魚心臟特異表達基因的轉基因模型，同時可以調控插入片段的表達。

技術領域

本發明涉及基因工程領域，具體涉及一種斑馬魚心臟特異表達模型的構建方法及相關載體。

背景技術

斑馬魚是目前應用廣泛的一種模式動物，在發育生物學領域具有舉足輕重的地位。斑馬魚在胚胎發育研究中，有很多優越性，其胚胎發育快，器官發育進程明顯，易于追蹤檢測。目前已經用于的心臟模型、腦模型、肝臟模型、眼模型等的構建，是熱門的動物模型，特別是在發育生物學領域。隨著雙光子干涉顯微鏡的應用，在體實時觀察成為有效的手段。

在分子生物學研究中，用CRISPR/Cas9技術產生DNA的雙鏈缺失，提供了新的基因敲除、基因敲入和各種基因組重排，如染色體缺失、反轉、重復和易位的途徑。目前，迅速發展的微同源末端接合MMEJ機制，已經發現可以替代傳統的雙鏈缺失修復途徑，穩定地用于工具酶介導的基因敲除實驗。進一步的研究表明NHEJ，HR和MMEJ在不同的細胞核動物模型中雙鏈缺失修復效率是不同的，MMEJ在哺乳動物細胞和模式動物，如斑馬魚小鼠、大鼠、等，表現得更加高效。Cre/LoxP技術，包括Cre重組酶由大腸桿菌噬菌體P1的Cre基因編碼，是由343個氨基酸組成的38kD的蛋白質，它不僅具有催化活性，而且與限制酶相似，能夠特異性識別LoxP位點；LoxP位點長為34bp，包括兩個13bp的反向重復序列和一個8bp的間隔區域。其中，反向重復序列是Cre重組酶的特異識別位點，而間隔區域決定了LoxP位點的方向。

目前尚未有斑馬魚心臟模型構建的報道。

發明內容

本發明的目的是提供一種斑馬魚心臟特異表達模型的構建方法及相關載體，該方法是一種CRISPR/Cas9介導的、在斑馬魚色素基因內整合心臟特異表達的啟動子，啟動下游熒光報告基因等的表達可以通過顯微鏡捕捉熒光信號，同時通過色素衰退輔助篩選，構建成斑馬魚心臟特異表達模型，待斑馬魚成年后，通過對下一代斑馬魚受精卵注射Cre酶，可以特異性將LoxP位點之間引入的外源序列刪除，恢復色素基因表達，達到對插入片段的調控表達。其主要原理是：首先應用CRISPR/Cas9技術，在斑馬魚色素基因內靶向剪切形成雙鏈斷裂，結合MMEJ機理提高微同源重組的效率，將外源片段引入；其次，構建的同源重組載體是針對色素基因設計的，敲除色素基因后可以影響色素合成導致斑馬魚黑色素合成障礙，不但可以作為輔助篩選標記，而且利于心臟的觀察；再次，利用MMEJ機理將靶點兩側上下游各40bp作為同源序列，同時加入EGFP報告基因或者需要在心臟特異表達的目的基因，通過獲得EGFP表達的陽性斑馬魚個體，從而構建成可以通過熒光實時檢測的斑馬魚心臟特異表達模型；最后，利用Cre/LoxP技術，待斑馬魚成年后，通過對下一代斑馬魚受精卵注射Cre酶mRNA或者表達Cre的斑馬魚品系進行交配，可以特異性將同向排列的LoxP位點之間引入的外源序列刪除，恢復色素基因表達，達到對插入片段的調控表達。依靠以上優勢，可以快速構建斑馬魚心臟特異表達模型，同時可以調控插入基因的表達。

為了實現上述目的，本發明的技術方案如下：

一種插入片段，包括斑馬魚心臟特異表達的啟動子、融合LoxP位點序列的左側同源臂和右側同源臂、內部核糖體進入位點、報告基因、轉錄終止信號片段；其中，所述啟動子位于報告基因上游，所述終止信號位于報告基因下游，左側同源臂位于啟動子上游，右側同源臂位于終止信號下游，同源臂的內側(即3’端)含有LoxP序列；左側同源臂和右側同源臂靶向斑馬魚色素基因。