[發明專利]利用單亞基RNA聚合酶進行體外轉錄合成sgRNA的方法

有效

• 申請號: 201810939835.1
• 申請日: 2018-08-17
• 公開（公告）號: CN108998483B
• 公開（公告）日: 2021-04-30
• 發明（設計）人: 朱斌;陸雪玲;夏恒;黃鋒濤;吳慧;余兵兵;閆艷
• 申請（專利權）人: 武漢核圣生物技術有限公司
• 主分類號: C12P19/34
• 分類號: C12P19/34
• 代理公司: 南京縱橫知識產權代理有限公司 32224
• 代理人: 徐瑛;祝蓉蓉

本發明公開一種利用單亞基RNA聚合酶進行體外轉錄合成sgRNA的方法，所述的單亞基RNA聚合酶，為來自KMV類噬菌體的單亞基RNA聚合酶，通過研究發現KP34RNA聚合酶在T7和Syn5轉錄系統的幾個薄弱環節中顯示出明顯的優勢，尤其是能產生精確均一的產物末端及對富含二級結構的RNA(如sgRNA)轉錄效果非常好。針對這一特性，利用該聚合酶合成的sgRNA末端均一性很高，提供了一個可以按需定制的DNA定點剪切工具，其效率高，成本低。

技術領域

本發明屬于微生物核酸代謝酶研究領域，具體涉及利用單亞基RNA聚合酶進行體外轉錄合成sgRNA的方法。

背景技術

SgRNA(single-guide RNA)是CRISPR基因編輯系統中重要的組成部分，早先發現的guide RNA由兩部分組成—crRNA和tracRNA,兩者“雙劍合璧”后，即sgRNA能更方便也更穩定的行使定點導向的功能，與Cas9蛋白結合，引導Cas9蛋白靶向剪切目的基因。CRISPR是大多數細菌及古細菌中的一種獲得性免疫方式，是一套很巧妙的系統。它先把外來的DNA片段整合進細菌自己的基因組，然后轉錄出RNA，經過一些剪切后，并利用這些guide RNA把帶有核酸內切酶活性的Cas蛋白直接引導到外源序列的位置，將外源DNA切斷。對細菌或古細菌而言，就完成了對外來病原體的快速精準的打擊。

至于最近很火的CRISPR技術其實是利用CRISPR系統中的RNA引導Cas蛋白去切斷目標DNA的這一個步驟。當然CRISPR的爆火主要還是由于這套技術好用，是因為要達成基因敲除的目的，只需把兩個質粒導入細胞即可大功告成。一個是含有Cas9蛋白的表達基因，它可以切斷雙鏈DNA。另一個是用來表達sgRNA,前一部分與目標基因配對，后一部分可形成發夾結構與Cas9蛋白結合，切斷目標基因。這是傳統構建CRISPR系統的方法。隨著RNA研究的發展及RNA導入細胞方法的完善，目前也可以通過將Cas9 mRNA和sgRNA導入細胞而發揮基因編輯功能。RNA轉運至細胞內就可以翻譯成蛋白質或直接發揮作用后被迅速降解，與導入質粒法不同(DNA會一直存在細胞中)，這種方法不會造成基因突變的危險。

SgRNA的體外制備方法有化學合成和酶法合成這兩種。由于RNA本身不穩定的性質，RNA的化學合成遠不如DNA合成高效，目前化學合成RNA多限于短RNA(幾個到幾十個核苷酸長度)，且合成費用高。酶法合成RNA是在RNA聚合酶體外轉錄基礎上建立的生物制備方法。相對于化學合成，酶法合成具有效率高、條件溫和的特性，能夠合成長序列RNA，更易于實現較大規模生產,是一種發展前景良好的RNA合成方法。目前體外酶法合成RNA主要是利用T7 RNA聚合酶，在體外從帶有T7啟動子序列的DNA模版上反復轉錄產生大量所需的RNA。雖然大部分生物自身擁有RNA聚合酶，但是大多都具有復雜的亞基組成和調控機制，不適合用作體外合成RNA的酶工具，這使得T7 RNA聚合酶幾乎成為了RNA酶法合成中唯一的工具酶。

T7 RNA聚合酶于四十年前被鑒定，其選擇受限于當時已發現的有限噬菌體種類，無法保證它是一個最理想的RNA合成工具酶。它的最主要缺點包括：提前終止、延伸性能弱、產物末端不均一、必須以鳥苷酸起始、對修飾核苷酸摻入效率低、對富含高級結構的RNA轉錄效率低等等，以致很多情況下所需的RNA無法有效合成。因而選擇T7作為體外合成RNA的標準酶具有很大的隨機性。在隨后的數十年中，人們對T7 RNA聚合酶進行了大量的優化和改造，相關論文和專利不計其數，然而這個酶并不是天然為RNA體外合成而設，其主要缺點越來越成為RNA這一熱門研究和應用領域的限制因素。