[發(fā)明專利]利用單亞基RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成sgRNA的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810939835.1
• 申請(qǐng)日: 2018-08-17
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108998483B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-04-30
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱斌;陸雪玲;夏恒;黃鋒濤;吳慧;余兵兵;閆艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢核圣生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12P19/34
• 分類號(hào): C12P19/34
• 代理公司: 南京縱橫知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224
• 代理人: 徐瑛;祝蓉蓉

1.利用單亞基RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成sgRNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1、獲得轉(zhuǎn)錄合成sgRNA的DNA模板；

S2、加入所述單亞基RNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄模板，pH8.0Tris-HCl，DTT，氯化鎂，亞精胺，四種核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNA酶抑制劑，無(wú)機(jī)焦磷酸酶，DEPC水混合后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)；

S3、加入DNase I去除DNA模板；

S4、純化回收轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物；所述單亞基RNA聚合酶為類噬菌體KP34的RNA聚合酶，所述sgRNA如序列表SEQ ID NO.1所示，所述sgRNA末端有一串polyU結(jié)構(gòu)；

合成的DNA寡核苷酸作模板:所述DNA模板為兩條互補(bǔ)的DNA單鏈，所述兩條互補(bǔ)的DNA單鏈包括正向單鏈和互補(bǔ)鏈，所述正向單鏈的堿基序列如序列表SEQ ID NO.2所示，所述互補(bǔ)鏈的堿基序列如序列表SEQ ID NO.3所示。

2.如權(quán)利要求1所述的利用單亞基RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成sgRNA的方法，其特征在于，步驟S2所述轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的溫度為37℃，反應(yīng)時(shí)間為1-2h。

3.如權(quán)利要求1所述的利用單亞基RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄合成sgRNA的方法，其特征在于，步驟S4所述純化轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的方法有試劑盒純化法、乙醇沉淀法、RNA氯化鋰沉淀法。