[發(fā)明專利]一種檢測BRAF基因突變的方法及其試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810939092.8
• 申請日: 2018-08-17
• 公開（公告）號: CN109161594A
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 蔣析文;朱小亞;顏爾聰
• 申請（專利權(quán)）人: 中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 上海助之鑫知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31328
• 代理人: 陳詳

本發(fā)明提供了一種檢測BRAF基因突變的方法及其試劑盒，具體地本發(fā)明提供了一種基于數(shù)字PCR技術(shù)檢測BRAF基因突變的方法及其試劑盒，該試劑盒包括用于配制數(shù)字PCR反應(yīng)液的酶和適用于數(shù)字PCR的引物探針組合。與傳統(tǒng)PCR技術(shù)相比，本發(fā)明采用數(shù)字PCR克服了傳統(tǒng)PCR技術(shù)檢測限高、準(zhǔn)確度低的缺點，本發(fā)明中使用的引物探針可同時檢測BRAF的多個位點突變，大大提高了通用性。使用本發(fā)明的檢測方法和試劑盒，樣品需求量少，靈敏度和特異性高，檢測效率大大提高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)和基因檢測領(lǐng)域，具體涉及一種檢測BRAF基因V600陽性突變的引物、探針及其試劑盒。

背景技術(shù)

位于染色體7q34的BRAF基因編碼絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，與ARAF、CRAF同屬于RAF家族。BRAF基因的突變可發(fā)生在原發(fā)性和轉(zhuǎn)移性腫瘤中。研究表明，7-8％的腫瘤發(fā)生BRAF基因點突變，包括約40-68％惡性黑色素瘤、5-20％甲狀腺乳頭狀癌、5-15％結(jié)腸癌以及3％肺癌等。目前已發(fā)現(xiàn)的BRAF基因突變類型達(dá)40余種，主要位于CR3激酶結(jié)構(gòu)域的第15外顯子及第11外顯子，其中BRAF最常見突變形式(大約95％)為第15外顯子的第1799位核苷酸上纈氨酸(T)突變?yōu)楣劝彼?A)，即V600E，其他已被報道的有V600D，V600K。BRAF是RAS-RAF-MEK-ERK MAPK信號通路重要的轉(zhuǎn)導(dǎo)因子，BRAF突變可直接導(dǎo)致絲裂原活化的細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(mitogen-activated extracellularsignal-regulated kinase,MEK)活化并繼續(xù)活化ERK，致使MAPK通路被持續(xù)激活，進(jìn)而導(dǎo)致細(xì)胞周期和循環(huán)失控，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生。

由于BRAF基因突變可引起腫瘤耐藥以及患者預(yù)后差等問題，BRAF基因突變已被認(rèn)為是腫瘤患者預(yù)后評估的一個獨立指標(biāo)。因此，對腫瘤患者特別是晚期腫瘤患者進(jìn)行BRAF基因突變位點的檢測顯得非常必要，這有助于判斷治療效果，也有助于臨床醫(yī)生選取對應(yīng)的靶向治療藥物從而制定腫瘤個體化治療方案。

針對惡性黑色素瘤，甲狀腺癌，結(jié)直腸癌，非小細(xì)胞肺癌等患者中出現(xiàn)的BRAF基因突變，已有的臨床常用檢測手段主要包括：測序法和實時熒光定量法等。這兩種檢測方法均需要從腫瘤組織中提取DNA后進(jìn)行基因突變檢測，這為患者在治療過程中進(jìn)行實時監(jiān)測帶來困難。

因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)靈敏度更強(qiáng)、精確度更高，且樣品需求量少的基因突變檢測方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種檢測BRAF基因突變的方法及其試劑盒。

在本發(fā)明的第一方面，提供了一種用于數(shù)字PCR檢測BRAF基因V600突變的通用引物對，所述通用引物對包括通用上游引物F和通用下游引物R；其中，所述通用上游引物F的核苷酸序列如SEQ ID NO.:1所示，所述通用下游引物R的核苷酸序列如SEQ ID NO.:2所示。

本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于數(shù)字PCR檢測BRAF基因V600突變的探針組，所述探針組包括選自下組的一種或多種探針：探針T1、探針T2、探針T3、和探針T4；其中，所述探針T1核苷酸序列如SEQ ID NO.:3所示，所述探針T2核苷酸序列如SEQ ID NO.:4所示，所述探針T3核苷酸序列如SEQ IDNO.:5所示，所述探針T4核苷酸序列如SEQ ID NO.:6所示。

在另一優(yōu)選例中，所述探針組包括：探針T1、探針T2、探針T3、和探針T4。

在另一優(yōu)選例中，所述探針T1的5’端包含有熒光報告基團(tuán)VIC；和/或，所述探針T1的3’端包含有淬滅基團(tuán)MGB。

在另一優(yōu)選例中，所述探針T2、所述探針T3、或所述探針T4的5’端包含有熒光報告基團(tuán)FAM；和/或，所述探針T2、所述探針T3、或所述探針T4的3’端包含有淬滅基團(tuán)MGB。