[發(fā)明專利]一種豬用疫苗載體

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810938346.4
• 申請日: 2015-07-10
• 公開（公告）號: CN109652450A
• 公開（公告）日: 2019-04-19
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 杜恩岐
• 申請（專利權(quán)）人: 陜西諾威利華生物科技有限公司;武漢中拓康明生物科技有限公司;陜西溯源農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司;黃光東
• 主分類號: C12N15/866
• 分類號: C12N15/866;C12N15/66;A61K39/187;A61P31/14
• 代理公司: 暫無信息
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本發(fā)明公開了一種豬瘟用疫苗載體，屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域。本發(fā)明的制備方法采用克隆豬IgG Fc基因和豬瘟病毒E2基因，與桿狀病毒表面展示載體連接，獲得重組轉(zhuǎn)移載體；重組轉(zhuǎn)移載體通過Tn7轉(zhuǎn)座獲得重組桿狀病毒Bacmid載體；重組Bacmid用脂質(zhì)體方法轉(zhuǎn)染昆蟲細(xì)胞，收集培養(yǎng)物上清，獲得重組桿狀病毒，重組桿狀病毒感染昆蟲細(xì)胞，收集細(xì)胞做Western blot分析和共聚焦顯微鏡分析；重組桿狀病毒豬瘟載體在豬體做疫苗效力檢驗。本發(fā)明制備的表面展示豬IgG Fc重組桿狀病毒在豬血清中具有較強的存活能力，可逃逸給血清補體對病毒的清除，從而提高疫苗免疫的有效抗原含量。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種豬用疫苗載體。

背景技術(shù)

桿狀病毒(Baculovirus)是一種以昆蟲為唯一宿主的病毒，可用做生物殺蟲劑或作為表達(dá)載體在昆蟲細(xì)胞中大量表達(dá)外源蛋白，制備疫苗。研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物細(xì)胞中攜帶哺乳動物啟動子的重組桿狀病毒能啟動下游外源基因的表達(dá)但病毒不能在哺乳動物細(xì)胞中增值，對細(xì)胞毒性小，轉(zhuǎn)導(dǎo)成功的細(xì)胞可以穩(wěn)定傳代并有效表達(dá)外源基因，哺乳動物細(xì)胞比昆蟲細(xì)胞對蛋白質(zhì)具有更好的翻譯后修飾，表達(dá)出的蛋白結(jié)構(gòu)更接近天然蛋白。因此，桿狀病毒可作為一種新型的哺乳動物細(xì)胞基因轉(zhuǎn)移載體，用于表達(dá)外源基因及作為一種基因治療載體，具有巨大潛力，日益受到人們的關(guān)注。

桿狀病毒能夠進(jìn)入哺乳動物體內(nèi)的某些細(xì)胞，但是在這些細(xì)胞內(nèi)不能進(jìn)行復(fù)制。研究人員利用這個特點將其改造為一個攜帶基因的工具，并進(jìn)行一定的修飾加工，將其改造成定向攜帶的載體，攜帶基因、藥物到達(dá)指定的部位。但是，桿狀病毒對機體來說畢竟是一個異類，機體對它有免疫作用，這不利于病毒進(jìn)入指定部位，為了解決這個問題，就在桿狀病毒基因內(nèi)部引入了補體抑制分子，補體抑制分子的引入能夠抑制機體對重組病毒的免疫應(yīng)答，使桿狀病毒重組體在傳輸過程中經(jīng)過血清時被消滅的危險。

桿狀病毒表面展示系統(tǒng)是近年發(fā)展起來的一種新型真核生物表面展示系統(tǒng)，因其具有外源片段長度選擇范圍大，增值速度快，可以很好地保持外源蛋白的原始活性等優(yōu)點，目前已被廣泛的應(yīng)用于新型疫苗研制、基因轉(zhuǎn)導(dǎo)與基因治療、展示復(fù)雜的真核蛋白、構(gòu)建多肽文庫和抗體庫以及單克隆抗體的制備等領(lǐng)域。gp64是目前桿狀病毒表面展示系統(tǒng)的基礎(chǔ)，是出芽型病毒特有的結(jié)構(gòu)蛋白，也叫膜粒蛋白(peplomer protein)，成熟后嵌合在病毒囊膜上，有二聚體、三聚體、四聚體3種存在方式?，F(xiàn)在使用最廣泛的桿狀病毒展示系統(tǒng)是AcMNPV和BmNPV，構(gòu)建的方式是在其gp64的信號肽與成熟蛋白之間插入外源基因，外源基因與gp64蛋白融合表達(dá)，加工后因信號肽的切除形成N端融合蛋白，這種蛋白成熟后就嵌合在細(xì)胞膜或病毒囊膜上，這樣外源基因就被表現(xiàn)在細(xì)胞或病毒表面，經(jīng)簡單篩選過程即可得到表達(dá)有特異蛋白的桿狀病毒粒子。

口炎皰疹病毒G蛋白(Vesicular stomatatis virus G protein，VSVG)對于多種不同類型和組織來源的哺乳動物細(xì)胞具有較好的通用性，能顯著增強一些對桿狀病毒不敏感的哺乳動物細(xì)胞株如CHO、NIH3T3等的轉(zhuǎn)導(dǎo)效率，然而經(jīng)VSVG修飾桿狀病毒后可增加細(xì)胞毒性并促使細(xì)胞融合。隨后，研究人員將VSV-GED(水泡性口炎病毒外功能區(qū)，由21個氨基酸構(gòu)成，包括跨膜區(qū)域和胞質(zhì)尾區(qū))融合表達(dá)于桿狀病毒囊膜蛋白gp64，對細(xì)胞造成的影響則可忽略不計。

免疫球蛋白Fc不僅是決定Ig免疫功能的重要部位，而且是IgG在體內(nèi)保持較長半衰期的主要原因。由于Ig Fc具有穩(wěn)定蛋白的作用，它被用來與多種蛋白融合，希望以此增強蛋白穩(wěn)定性，延長其體內(nèi)半衰期。Ig Fc可形成多聚合分子，使重組蛋白具有更強的抗原結(jié)合力，同時Ig Fc具有抗原提呈細(xì)胞受體而易被抗原提呈細(xì)胞所攝取，從而可用于提高小分子抗原的免疫應(yīng)答能力。桿狀病毒表面展示Ig Fc可以增加其與抗原呈遞細(xì)胞的結(jié)合。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于針對現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種豬IgG1Fc重組桿狀病毒作為豬用疫苗載體的制備方法。