[發明專利]一種基于γ-H2AX的生物標志物遺傳毒性檢測方法

在審

• 申請號: 201810936276.9
• 申請日: 2018-08-16
• 公開（公告）號: CN110836972A
• 公開（公告）日: 2020-02-25
• 發明（設計）人: 黃鵬程;李若婉;周長慧;常艷
• 申請（專利權）人: 上海益諾思生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N15/14
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;呂學辰

本發明公開了一種基于γ?H2AX的生物標志物遺傳毒性檢測方法。該檢測方法包括下述步驟：(1)將與計數微珠混合后的待檢測細胞與抗體、以及通透液和封閉液混合、孵育后使用流式細胞儀進行熒光檢測；所述的抗體包括抗γ?H2AX抗體、p53蛋白抗體、磷酸化組蛋白H3抗體和抗Cleaved PARP抗體；(2)結果分析：排除死亡細胞，并通過Cleaved?PARP陽性排除凋亡細胞后，根據活細胞的γ?H2AX的表達分析細胞毒性信息。該檢測方法檢測體外細胞遺傳毒性的方法簡便、快速、準確并且可以提供多種機制信息的體外遺傳毒性檢測方法。

技術領域

本發明屬于遺傳毒性檢測領域，具體涉及一種基于γ-H2AX的生物標志物的遺傳毒性檢測方法。

背景技術

在不同DNA損傷中，DNA雙鏈斷裂是最為嚴重的一種，而DNA損傷又與化學品的遺傳毒性密切相關。具有紡錘體毒性的化學品則可影響細胞紡錘絲的合成或者紡錘體的形成，從而導致細胞周期阻滯、細胞凋亡，嚴重時可導致細胞染色體組出現非整倍體變化。細胞染色體的非整倍體性可導致多種疾病，例如21三體綜合征等，而癌癥的形成也于細胞的非整倍體性有密切的相關性。檢測化合物誘導細胞的DNA損傷和非整倍體變化成為評價化合物遺傳毒性的重要標志物。

現階段遺傳毒性檢測的常用體外試驗主要包括細菌回復突變試驗(Ames試驗)、哺乳動物細胞染色體畸變試驗、哺乳動物細胞微核試驗和哺乳動物細胞彗星試驗等。這些體外檢測方法在藥物等的遺傳毒性安全評價方面發揮著重要作用，也是目前國內外現階段主要使用的檢測方法。但是，這些體外方法有很多局限性：(1)假陽性結果比例較高；(2)目前常用的用于體外遺傳毒性檢測的細胞系(如CHL、CHO-K1細胞系等)多為嚙齒類動物來源的細胞，試驗結果外推至人體試驗的符合性較差(黃鵬程,周長慧,常艷.基于γ-H2AX生物標志物DNA遺傳毒性檢測方法的研究進展[J].中國新藥雜志,2016(4):418-424.)(3)目前常用的遺傳毒性試驗使用的細胞株均缺乏p53基因，DNA損傷修復機制不完整(歐紅梅,周長慧,涂宏剛,常艷.p53基因狀態對體外微核試驗結果影響的研究進展[J].中國藥理學與毒理學雜志,2015,29(01):170-173.)?，F有藥物等化學品的遺傳毒性性評價常用遺傳毒性體外實驗和動物模型對評價結果尤其是在將結果外推于人類時造成較大的不確定性，可能造成化學品由于假陽性結果而終止繼續研發。同時，常用的體外遺傳毒性評價方法，均不能直接提供化合物誘導非整倍體效應的評價指標。針對目前常用體外遺傳毒性評價方法的局限性，將人源化體外培養的細胞株應用于遺傳毒性評價，并整合多種生物標志物檢測DNA雙鏈斷裂劑和非整倍體誘導劑，有望建立一種良好體外遺傳毒性評價方法。

發明內容

本發明要解決的技術問題是針對現有技術中用于檢測體外細胞遺傳毒性的方法假陽性率高、靈敏度低以及檢測指標少等缺陷，提供一種基于γ-H2AX的生物標志物的遺傳毒性檢測方法。該檢測體外細胞遺傳毒性的方法簡便、快速、準確并且可以提供多種機制信息的體外遺傳毒性檢測方法。

影響γ-H2AX生物標志物DNA遺傳毒性檢測方法的假陽性率高的主要原因在于正常死亡細胞(即凋亡細胞)的存在(Maria Tsamou,Danyel G.J.Jennen,SandraM.H.Claessen,ChristinaMagkoufopoulou,Jos C.S.Kleinjans and Joost H.M.vanDelft.Performance of in vitroγH2AXassay in HepG2cells to predict in vivogenotoxicity[J].Mutagenesis,2012,27(6),645–652.)；而如何提高檢測的特異性、降低假陽性率并保證檢測的靈敏度一直是本領域內亟待解決的問題。發明人創造性地從PI細胞核單染、細胞膜表面磷脂酰絲氨酸(Annexin V)以及半胱天冬酶3(Caspase-3)以及DNA修復酶PARP的切割底物Cleaved-PARP等眾多細胞凋亡標志物中挑選Cleaved-PARP用于本發明以降低假陽性率，解決了本領域內的技術難題，促進了領域中遺傳毒性的檢測方法的發展。