[發明專利]一種基于γ-H2AX的生物標志物遺傳毒性檢測方法

在審

• 申請號: 201810936276.9
• 申請日: 2018-08-16
• 公開（公告）號: CN110836972A
• 公開（公告）日: 2020-02-25
• 發明（設計）人: 黃鵬程;李若婉;周長慧;常艷
• 申請（專利權）人: 上海益諾思生物技術股份有限公司
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N15/14
• 代理公司: 上海弼興律師事務所 31283
• 代理人: 薛琦;呂學辰

1.一種基于γ-H2AX的生物標志物遺傳毒性檢測方法，其特征在于，所述的生物標志物遺傳毒性檢測方法包括下述步驟：

(1)將與計數微珠混合后的待檢測細胞與抗體、以及通透液和封閉液混合、孵育后使用流式細胞儀進行熒光檢測；所述的抗體包括抗γ-H2AX抗體和抗Cleaved-PARP抗體；

(2)結果分析：排除死亡細胞，并通過Cleaved-PARP陽性排除凋亡細胞后，根據活細胞的γ-H2AX的表達分析細胞毒性信息。

2.如權利要求1所述的生物標志物遺傳毒性檢測方法，其特征在于，所述的遺傳毒性為化學物質的遺傳毒性；和/或，步驟(1)中所述的待檢測細胞為人成淋巴TK6細胞。

3.如權利要求1所述的生物標志物遺傳毒性檢測方法，其特征在于，所述的生物標志物遺傳毒性檢測方法中還將p53基因作為生物標志物；較佳地，步驟(1)中所述的抗體還包括抗p53蛋白抗體；

和/或，所述的生物標志物遺傳毒性檢測方法還將組蛋白H3作為生物標志物，將步驟(1)中所述的與計數微珠混合后的待檢測細胞的一部分與抗組蛋白H3抗體、通透液和封閉液混合、孵育后使用流式細胞儀進行熒光檢測。

4.如權利要求1所述的生物標志物遺傳毒性檢測方法，其特征在于，步驟(1)中所述的封閉液為1％牛白蛋白，所述的通透液為1×Perm/Wash buffer。

5.如權利要求1所述的生物標志物遺傳毒性檢測方法，其特征在于，步驟(1)中所述的待檢測細胞經過下述處理后得到：①固定待檢測細胞；②使用帶有計數微珠的試劑對固定所得的待檢測細胞進行洗脫，或者對固定所得的待檢測細胞進行洗脫后再加入計數微珠；較佳地：

步驟①中用于所述固定的試劑為70％乙醇，優選-20℃預冷的70％乙醇，所述固定的時間為14～18小時，優選16小時；

和/或，步驟②中用于所述洗脫的試劑為PBS溶液，優選計數微珠濃度為(0.8～1.2)×10⁴個/mL的PBS溶液，更優選計數微珠濃度為1×10⁴個/mL的PBS溶液。

6.如權利要求1～5任一項所述的生物標志物遺傳毒性檢測方法，其特征在于，所述的生物標志物遺傳毒性檢測方法包括下述步驟：

(1)固定待檢測細胞；

(2)使用帶有計數微珠的試劑對固定所得的待檢測細胞進行洗脫，或者對固定所得的待檢測細胞進行洗脫后再加入計數微珠

(3)將步驟(2)處理過的待檢測細胞分為兩份，一份與抗γ-H2AX抗體、抗Cleaved PARP抗體和抗p53蛋白抗體，以及通透液和封閉液混合并孵育，另一份與組蛋白H3，以及通透液和封閉液混合并孵育；再使用流式細胞儀進行熒光檢測；

(4)結果分析：排除死亡細胞，并通過Cleaved-PARP陽性排除凋亡細胞后，根據活細胞的γ-H2AX、p53蛋白、組蛋白H3的表達分析細胞毒性信息，γ-H2AX、p53蛋白表達陽性可提示致遺傳毒性機制為斷裂劑；組蛋白H3和p53蛋白表達陽性可提示致遺傳毒性機制為非整倍體誘導劑；γ-H2AX、組蛋白H3和p53蛋白表達陰性提示沒有致遺傳毒性作用。

7.一種基于γ-H2AX的生物標志物遺傳毒性檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒包括抗Cleaved PARP抗體以及抗γ-H2AX抗體。

8.如權利要求7所述的生物標志物遺傳毒性檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括抗p53蛋白抗體和/或抗組蛋白H3抗體。

9.如權利要求7或8所述的生物標志物遺傳毒性檢測試劑盒，其特征在于，所述的試劑盒還包括PBS、計數微珠、封閉液和/或通透液；所述的封閉液優選1％牛白蛋白，所述的通透液優選1×Perm/Wash buffer。

10.Cleaved-PARP在基于γ-H2AX的生物標志物的遺傳毒性檢測方法中的應用。