[發(fā)明專(zhuān)利]一種塞內(nèi)卡谷病毒重組質(zhì)粒、重組病毒及構(gòu)建方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810935306.4
• 申請(qǐng)日: 2018-08-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN109022374B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-05-14
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 錢(qián)平;李祥敏;劉婷婷;錢(qián)蘇紅;陳煥春
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12N7/01
• 分類(lèi)號(hào): C12N7/01;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 北京高沃律師事務(wù)所 11569
• 代理人: 劉奇

本發(fā)明涉及一種塞內(nèi)卡谷病毒重組質(zhì)粒、重組病毒及構(gòu)建方法，屬于病毒構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明提供的塞內(nèi)卡谷重組病毒為：衣殼VP2的GH環(huán)第177位氨基酸由S突變?yōu)锳的塞內(nèi)卡谷病毒。本發(fā)明提供的塞內(nèi)卡谷重組病毒具有高病毒滴度和病毒增殖能力。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及病毒構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種塞內(nèi)卡谷病毒重組質(zhì)粒、重組病毒及構(gòu)建方法。

背景技術(shù)

塞內(nèi)卡谷病毒(Seneca Valley Virus，SVV)，屬于小RNA病毒中的一員，具有溶瘤特性，可以選擇性地感染具有神經(jīng)內(nèi)分泌性的腫瘤細(xì)胞，它在臨床前研究和早期臨床試驗(yàn)中顯示了癌癥治療的前景。已有文獻(xiàn)報(bào)道通過(guò)全基因組功能損失的篩選，發(fā)現(xiàn)炭疽毒素受體1(ANTXR1)，也稱(chēng)為腫瘤內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)志物8(TEM8)蛋白，是塞內(nèi)卡谷病毒入侵宿主細(xì)胞的必要受體。SVV與ANTXR1的相互作用直接且特殊，這種相互作用需要SVV結(jié)合到受體細(xì)胞上，并且為了避免干擾素基因的抗病毒活性，受體細(xì)胞上需要高表達(dá)ANTXR1，SVV的核衣殼直接識(shí)別ANTXR1受體。目前SVV的感染特征、宿主范圍和流行病學(xué)的許多方面尚不清楚，而且還沒(méi)有商品化的疫苗進(jìn)行防控。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種塞內(nèi)卡谷病毒重組質(zhì)粒、重組病毒及構(gòu)建方法。本發(fā)明提供的塞內(nèi)卡谷重組病毒具有高病毒滴度和病毒增殖能力。

本發(fā)明提供了一種塞內(nèi)卡谷重組病毒，所述塞內(nèi)卡谷重組病毒為：衣殼VP2的GH環(huán)第177位氨基酸由S突變?yōu)锳的塞內(nèi)卡谷病毒。

本發(fā)明還提供了一種塞內(nèi)卡谷病毒重組質(zhì)粒，所述塞內(nèi)卡谷病毒重組質(zhì)粒為負(fù)載上述技術(shù)方案所述塞內(nèi)卡谷重組病毒全長(zhǎng)核苷酸序列的質(zhì)粒。

優(yōu)選的是，用于負(fù)載上述技術(shù)方案所述塞內(nèi)卡谷重組病毒全長(zhǎng)核苷酸序列的質(zhì)粒包括pBluescriptII SK。

優(yōu)選的是，所述重組質(zhì)粒的全序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述重組質(zhì)粒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

1)擴(kuò)增SVV HB-CH-2016全長(zhǎng)基因組序列；

2)將所述基因組序列克隆至質(zhì)粒上，在所述基因組序列的5’端融合如SEQ IDNO.2所示的CMV啟動(dòng)子序列，在所述基因組序列的3’端融合如SEQ ID NO.3所示的丁型肝炎病毒核酶識(shí)別序列HDVr-poly序列，得到含塞內(nèi)卡谷病毒全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒；

3)將所述含塞內(nèi)卡谷病毒全長(zhǎng)基因的質(zhì)粒經(jīng)DpnI消化、重組環(huán)化后，進(jìn)行轉(zhuǎn)化以完成定點(diǎn)突變，得到塞內(nèi)卡谷病毒重組質(zhì)粒。

優(yōu)選的是，步驟1)所述SVV HB-CH-2016全長(zhǎng)基因組序列分四段進(jìn)行擴(kuò)增。

優(yōu)選的是，步驟3)所述定點(diǎn)突變采用快速定點(diǎn)突變?cè)噭┖羞M(jìn)行。

本發(fā)明還提供了上述技術(shù)方案所述塞內(nèi)卡谷重組病毒的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

將上述技術(shù)方案所述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞，離心收集上清液，得到塞內(nèi)卡谷重組病毒。

優(yōu)選的是，所述細(xì)胞包括293T細(xì)胞。

優(yōu)選的是，轉(zhuǎn)染時(shí)所述重組質(zhì)粒的質(zhì)量與細(xì)胞的個(gè)數(shù)比為1.0μg：(0.8～1.5)×10⁶個(gè)。

本發(fā)明提供了一種塞內(nèi)卡谷病毒重組質(zhì)粒。本發(fā)明將塞內(nèi)卡谷病毒衣殼的VP2的GH環(huán)第177位氨基酸由S突變?yōu)锳，得到塞內(nèi)卡谷重組病毒，所述塞內(nèi)卡谷重組病毒具有高病毒滴度和病毒增殖能力。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的pSKII-CMV-SVV/HB質(zhì)粒構(gòu)建路線圖；

圖2為本發(fā)明實(shí)施例1提供的野生病毒SVV和原始克隆病毒的鑒定圖；