[發明專利]一種豬瘟口服弱毒凍干疫苗及其制備方法有效
| 申請號： | 201810932703.6 | 申請日： | 2018-08-16 |
| 公開（公告）號： | CN108969492B | 公開（公告）日： | 2021-06-04 |
| 發明（設計）人： | 張志剛;胡江鋒;郭麗 | 申請（專利權）人： | 張志剛 |
| 主分類號： | A61K9/19 | 分類號： | A61K9/19;A61K47/42;A61K47/26;A61K47/18;A61K39/187;A61K39/39;A61P31/14 |
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| 地址： | 100000 北京市昌平*** | 國省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 一種 豬瘟 口服 弱毒凍干 疫苗 及其 制備 方法 | ||
1.一種豬瘟口服弱毒凍干疫苗，包括豬瘟弱毒病毒，凍干保護劑和疫苗稀釋液，其特征在于，所述疫苗稀釋液中包括黏膜免疫佐劑和免疫增強劑，所述黏膜免疫佐劑包括蜂膠提取物、左旋咪唑和卡波姆，所述免疫增強劑包括黃芪多糖和玉竹多糖；所述凍干保護劑包括質量百分含量為3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5-6%的乳糖，余量為水；每升所述疫苗稀釋液含有：130mM氯化鈉，3.0mM氯化鉀，10mM磷酸氫二鈉，2mM磷酸二氫鈉，1.2-1.5g卡波姆，2.4-3.0g左旋咪唑，2-4g蜂膠提取物，2-5g的黃芪多糖，1-2g的玉竹多糖。
2.根據權利要求1所述的豬瘟口服弱毒凍干疫苗，其特征在于，所述疫苗稀釋液的制備方法為：按以上用量將氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、卡波姆、左旋咪唑、蜂膠提取物、黃芪多糖和玉竹多糖溶解于注射用水中，定容至1L，按每頭份3-5mL的規格分裝后，于121℃高壓滅菌20min后備用。
3.根據權利要求1所述的豬瘟口服弱毒凍干疫苗，其特征在于，所述蜂膠提取物采用如下方法制備：稱取經冷凍粉碎、過40目篩的蜂膠10g，加入400mL的55%的乙醇溶液中，在60℃下超聲波提取15min，超聲波功率為480W，而后以3000r/min的速度離心10min，吸取上清液，用旋轉蒸發儀減壓濃縮至粘稠，于真空冷凍干燥機中冷凍干燥24h，即得到所述的蜂膠提取物。
4.根據權利要求1-3中任一項所述的豬瘟口服弱毒凍干疫苗，其特征在于，所述豬瘟口服弱毒凍干疫苗的制備方法，包括如下步驟：
步驟一，按照常規方法復蘇、傳代ST細胞，待ST細胞單層細胞融合度達80％左右時，棄去細胞上清，PBS洗滌一次；加入200μL稀釋后的豬瘟活疫苗毒株，37℃吸附1h；然后棄去上清，加入含2％FBS的DMEM維持液繼續培養；每天觀察細胞狀態，72h后收毒，將細胞放于-20℃/室溫反復凍融3次，然后12000rpm離心10min，去除細胞碎片，吸取200μL上清繼續重復上述操作，進行病毒的傳代培養；
步驟二，將收獲的病毒液混合取樣后按照《中華人民共和國獸藥典》附錄規定的方法進行RID的測定，測定結果顯示混合樣大于5×105RID/ml；
步驟三，凍干保護劑的制備：將質量百分含量為3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5-6%的乳糖，余量為去離子水，混合均勻后經高壓滅菌備用；
步驟四，配苗、凍干及分裝：在凍干保護劑中按照10000RID每頭份的量加入一定量的豬瘟弱毒病毒液，混勻后分裝為2ml/瓶，置于凍干機內，經預凍、升華過程凍干疫苗形成成品；
步驟五，成品檢驗：按照《中華人民共和國獸藥典》附錄規定的方法對成品進行無菌檢驗、霉菌檢驗、支原體檢驗、安全性檢驗和效力檢驗均合格，置于2～8℃保存備用；
步驟六，稀釋液制備：每升疫苗稀釋液含有：130mM氯化鈉，3.0mM氯化鉀，10mM磷酸氫二鈉，2mM磷酸二氫鈉，1.2-1.5g卡波姆，2.4-3.0g左旋咪唑，2-4g蜂膠提取物，2-5g的黃芪多糖，1-2g的玉竹多糖；所述疫苗稀釋液的制備方法為：按以上用量將氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、卡波姆、左旋咪唑、蜂膠提取物、黃芪多糖和玉竹多糖溶解于注射用水中，定容至1L，按每頭份3-5mL的規格分裝后，于121℃高壓滅菌20min后備用；
步驟七，將步驟五制備得到的凍干疫苗和步驟六制備得到的稀釋液按一頭份的量進行組合，裝盒、裝箱后保存。
5.一種豬瘟口服弱毒凍干疫苗的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：
步驟一，按照常規方法復蘇、傳代ST細胞，待ST細胞單層細胞融合度達80％左右時，棄去細胞上清，PBS洗滌一次；加入200μL稀釋后的豬瘟活疫苗毒株，37℃吸附1h；然后棄去上清，加入含2％FBS的DMEM維持液繼續培養；每天觀察細胞狀態，72h后收毒，將細胞放于-20℃/室溫反復凍融3次，然后12000rpm離心10min，去除細胞碎片，吸取200μL上清繼續重復上述操作，進行病毒的傳代培養；
步驟二，將收獲的病毒液混合取樣后按照《中華人民共和國獸藥典》附錄規定的方法進行RID的測定，測定結果顯示混合樣大于5×105RID/ml；
步驟三，凍干保護劑的制備：將質量百分含量為3%的牛血清白蛋白BSA、2%的甘露醇、2%的甘氨酸、5-6%的乳糖，余量為去離子水，混合均勻后經高壓滅菌備用；
步驟四，配苗、凍干及分裝：在凍干保護劑中按照10000RID每頭份的量加入一定量的豬瘟弱毒病毒液，混勻后分裝為2ml/瓶，置于凍干機內，經預凍、升華過程凍干疫苗形成成品；
步驟五，成品檢驗：按照《中華人民共和國獸藥典》附錄規定的方法對成品進行無菌檢驗、霉菌檢驗、支原體檢驗、安全性檢驗和效力檢驗均合格，置于2～8℃保存備用；
步驟六，稀釋液制備：每升疫苗稀釋液含有：130mM氯化鈉，3.0mM氯化鉀，10mM磷酸氫二鈉，2mM磷酸二氫鈉，1.2-1.5g卡波姆，2.4-3.0g左旋咪唑，2-4g蜂膠提取物，2-5g的黃芪多糖，1-2g的玉竹多糖；所述疫苗稀釋液的制備方法為：按以上用量將氯化鈉、氯化鉀、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、卡波姆、左旋咪唑、蜂膠提取物、黃芪多糖和玉竹多糖溶解于注射用水中，定容至1L，按每頭份3-5mL的規格分裝后，于121℃高壓滅菌20min后備用；
步驟七，將步驟五制備得到的凍干疫苗和步驟六制備得到的稀釋液按一頭份的量進行組合，裝盒、裝箱后保存。
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