[發明專利]利用SSR熒光測序技術鑒定酒花純度的方法

有效

• 申請號: 201810931030.2
• 申請日: 2018-08-15
• 公開（公告）號: CN108977567B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發明（設計）人: 尹花;董建軍;余俊紅;張志軍;岳杰;陳嶸;賀揚;劉明麗;張磊
• 申請（專利權）人: 青島啤酒股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895
• 代理公司: 青島清泰聯信知識產權代理有限公司 37256
• 代理人: 李祺;張潔

1.利用SSR熒光測序技術鑒定酒花純度的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)提取青島大花和麒麟豐綠以不同比例制備得到的酒花樣品混合物的DNA；

(2)選取4對SSR引物進行酒花品種鑒定，對提取樣品DNA進行PCR擴增，所述4對引物中的正向引物5'端均用Alexa Fluor 750熒光染料進行標記，

所述4對SSR引物序列如下：

(3)毛細管電泳熒光檢測；

(4)數據分析和標準曲線構建；

(5)基于構建的標準曲線，在測定酒花樣品混合物時，將不同比例下的麒麟豐綠與青島大花的峰面積比值代入方程，得出青島大花的實際純度。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增體系反應體積為20μL，含MgCl₂2.5mmol/L，dNTP 0.20mmol/L，正向引物0.06μmol/L，反向引物0.20μmol/L，Taq DNA聚合酶0.7單位，2×PCR緩沖液，所述緩沖液中不含Mg²⁺，樣品DNA 20ng。

3.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述PCR擴增的反應程序為：94℃預變性3min；94℃變性45s，58℃退火30s，72℃延伸1min，共30個循環；72℃延伸10min，4℃保存。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述毛細管電泳熒光檢測包括以下幾個步驟：

a、制備SLS/DSS混合液:取0.5μL DSS-400分子量內標，加入39.5μL SLS甲酰胺上樣緩沖液，震蕩混合均勻，加入樣品板中；

b、向樣品孔中加入1μL稀釋后的PCR產物,加一滴石蠟油覆蓋樣品；

c、在緩沖液板與樣本板對應孔內加入3/4體積的分離緩沖液；

d、將樣品板和緩沖液板放入GeXP遺傳分析系統儀中，操作條件為：進樣電壓2.0kV，時間30s；90℃變性120s；分離電壓6.0kV，時間35min。

5.根據權利要求4所述的方法，其特征在于，所述數據分析、標準曲線及回歸方程構建為：

對GeXP遺傳分析系統儀收集到的數據進行分析，統計得出不同酒花樣品混合物的SSR標記片段，對比所述SSR標記片段與DSS-400分子量內標，得到SSR標記片段長度大小。

6.根據權利要求5所述的方法，其特征在于，根據酒花樣品混合物擴增片段的毛細管電泳圖譜，將檢測峰判讀為對應的等位基因，根據等位基因大小進行青島大花與麒麟豐綠的品種區分；同時，將各檢測峰的峰面積記為相對熒光信號，以麒麟豐綠的添加比例為橫坐標X，麒麟豐綠與青島大花的峰面積比值為縱坐標Y建立標準曲線。

7.根據權利要求6所述的方法，其特征在于，麒麟豐綠的純度隨麒麟豐綠與青島大花的峰面積比值的增大而增大，隨麒麟豐綠與青島大花的峰面積比值的減小而減小。

8.根據權利要求1-7任一項所述的方法，其特征在于，麒麟豐綠的添加量＞1％。