[發明專利]人子宮內膜組織來源間充質干細胞的分離培養方法

在審

• 申請號: 201810930181.6
• 申請日: 2018-08-15
• 公開（公告）號: CN108998411A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 解軍;李仁科;范雪梅;宋慧芳;何生;平毅
• 申請（專利權）人: 山西醫科大學
• 主分類號: C12N5/0775
• 分類號: C12N5/0775;A61K35/28;A61P9/10;A61P25/28;A61P17/00
• 代理公司: 太原華弈知識產權代理事務所 14108
• 代理人: 李毅

1.一種具有強增殖能力的人子宮內膜組織來源間充質干細胞，所述人子宮內膜組織來源間充質干細胞從人的子宮內膜組織中分離得到。

2.權利要求1所述人子宮內膜組織來源間充質干細胞的分離培養方法，是通過酶解法消化人體子宮內膜組織獲得單細胞懸液，直接接種于間充質干細胞培養基中進行培養及傳代純化，獲得所述間充質干細胞。

3.根據權利要求2所述的人子宮內膜組織來源間充質干細胞的分離培養方法，其特征是按照下述步驟進行：

1）以含250～350μg/ml膠原酶Ⅲ和30～50μg/ml DNase I的PBS緩沖液為消化液，將所述消化液與人子宮內膜組織按照2～4∶1的體積比混合，37℃水浴震蕩消化40～60min后，抽取消化產物上清液，以1∶1的體積比加入10vol% FBS-DMEM/F12進行中和，終止消化后獲得單細胞懸液；

2）將所述單細胞懸液以200目細胞濾網過濾，1000～1200r/min離心獲得細胞團塊；

3）在所述細胞團塊中加入10vol% FBS-DMEM/F12培養基，37℃、5%CO₂細胞培養箱中培養，經不少于1次的傳代培養純化，分離得到人子宮內膜組織來源間充質干細胞。

4.權利要求1所述人子宮內膜組織來源間充質干細胞的分離培養方法，是通過酶解法消化人體子宮內膜組織獲得單細胞懸液，采用密度梯度離心法分離得到包含有間充質干細胞的細胞群，接種于間充質干細胞培養基中，進行培養及傳代純化，獲得所述間充質干細胞。

5.根據權利要求4所述的人子宮內膜組織來源間充質干細胞的分離培養方法，其特征是按照下述步驟進行：

1）以含250～350μg/ml膠原酶Ⅲ和30～50μg/ml DNase I的PBS緩沖液為消化液，將所述消化液與人子宮內膜組織按照2～4∶1的體積比混合，37℃水浴震蕩消化40～60min后，抽取消化產物上清液，以1∶1的體積比加入10vol% FBS-DMEM/F12進行中和，終止消化后獲得單細胞懸液；

2）將所述單細胞懸液以200目細胞濾網過濾，1000～1200r/min離心獲得細胞團塊；

3）分別配制密度為1.048～1.052g/ml，1.058～1.062g/ml，1.070～1.084g/ml的三種含有Percoll和Ads的梯度密度緩沖液，分別記為A液、B液和C液，其中B液以0.01g/l酚紅標識；

4）在加有A液的離心管中移入等體積的B液，輕輕插入離心管底部緩慢滴加在A液下方，形成兩層液體分離的界面；

5）用與A液等體積的C液重懸步驟2）獲得的細胞團塊，得到細胞懸液，將所述細胞懸液插入離心管底部緩慢加入在B液下方，形成具有無色-紅色-無色三層液體清晰分離界面的梯度密度緩沖液；

6）以1300～1700r/min離心，將細胞分散在梯度密度緩沖液的不同密度區域，吸取B液下方和C液上方區域的細胞懸液，放入預先加入15～30ml 10vol% FBS-DMEM/F12的離心管中，輕柔混勻；

7）1000～1300r/min離心獲得細胞團塊，加入10～20ml 10vol% FBS-DMEM/F12，輕柔混勻，1000～1300r/min離心并收集細胞團塊；

8）以10vol%FBS-DMEM/F12培養基重懸細胞團塊，接種于培養瓶或培養皿中，37℃、5%CO₂細胞培養箱中培養，經不少于1次的傳代培養純化，分離得到人子宮內膜組織來源間充質干細胞。

6.根據權利要求3或5所述的人子宮內膜組織來源間充質干細胞的分離培養方法，其特征是所使用的人子宮內膜組織是以PBS清洗干凈，并充分切碎的組織。

7.根據權利要求3或5所述的人子宮內膜組織來源間充質干細胞的分離培養方法，其特征是將所述人子宮內膜組織以所述消化液消化不少于2次，合并消化得到的細胞懸液。

8.權利要求1所述人子宮內膜組織來源間充質干細胞在制備預防或治療缺血性疾病的藥物中的應用。