[發明專利]一種羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫及構建方法

有效

• 申請號: 201810928386.0
• 申請日: 2018-08-15
• 公開（公告）號: CN108998443B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 陳國華;景志忠;賈懷杰;何小兵;房永祥;宋世斌
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06;C40B40/08
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

本發明提供了一種羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫的制備方法，包括制備羊睪丸成纖維細胞；提取羊睪丸成纖維細胞RNA；合成cDNA，進行cDNA文庫均一化；cDNA與pPR3?N載體連接，連接產物轉化宿主細胞DH5α，獲得羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫，并進行克隆驗證；篩選羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫等步驟。本發明的cDNA庫容量為7.5×10⁵，片段的大小為200?2000bp，平均長度為1000bp，文庫的重組率為100％。通過利用羊口瘡病毒的膜蛋白對文庫進行篩選，證明了該文庫是一個高質量的文庫。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及一種羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫及其構建方法和用途。

背景技術

羊口瘡(orf)亦稱羊傳染性膿皰、羊傳染性膿皰皮炎，是由羊口瘡病毒(orf virusORFV)引起的一種傳染性較強的人畜共患病。ORFV為痘病毒科(Poxviridae)、副痘病毒屬(Parapoxvirus)的代表之一；病毒粒子為橢圓形，長250～280nm，寬170～200nm；引起羊的一種病毒性傳染病，也可以感染人。感染羊口瘡病毒的羊生產性能下降、采食困難、消瘦并長期帶毒，給養羊業及飼養人員的健康帶來嚴重的危害。該病幾乎遍布全世界所有養羊的國家和地區，而且我國是該病流行嚴重的國家，每年感染ORFV的羊不少于500萬只。

一些研究者發現，能用于分離培養ORFV的原代細胞和細胞系有很多種，1957年羊口瘡病毒在羊胚胎原代細胞上成功復制此病毒，但細胞病變不是十分明顯。此后用犢牛睪丸原代細胞、羔羊睪丸原代細胞成功增殖了羊口瘡病毒，并觀察到了典型的細胞病變反應。但是羊睪丸細胞(LT)均是來源于羔羊睪丸，經解剖、剪碎、消化、培養而成的原代細胞，該細胞生長緩慢，繁殖一定代數后會停止生長，傳代次數有限，隨著傳代次數的升高，細胞活力降低，細胞形態也隨之越來越差，最后無法進行傳代，因此，羊睪丸細胞培養的質量的好壞，對于ORFV的分離和培養是十分重要的，而且羊睪丸細胞成為研究ORFV與宿主間相互作用的平臺。

發明內容

傳統的酵母雙雜交文庫只能檢測發生在核內的蛋白質間相互作用，無法檢測胞膜蛋白質間相互作用，也不能夠檢測一些蛋白質需在內質網或細胞質中經過轉錄后修飾的蛋白質，有鑒于此，本發明的目的在于提供一種羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫的制備方法,通過該方法構建的羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫克服了傳統酵母雙雜交文庫的局限，可用于檢測膜蛋白間的相互作用。

即本發明的第一方面在于提供一種羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫的制備方法，包括以下步驟：

1)制備羊睪丸成纖維細胞；

2)提取羊睪丸成纖維細胞RNA；

3)合成cDNA，進行cDNA文庫均一化；

4)cDNA與pPR3-N載體連接，連接產物轉化宿主細胞DH5α，獲得羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫，并進行克隆驗證；

5)篩選羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫。

優選地，本發明所述的羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫的制備方法中，所述羊睪丸成纖維細胞的制備方法包括：

1)無菌取出初生健康羔羊睪丸，用Hank’s液洗2-3次，剔除鞘膜、白膜后，再沖洗2-3次；

2)將睪丸實質剪成1-2mm大小的組織塊，加入4倍量的0.25％胰酶消化液，與37℃水浴中消化30-40分鐘；

3)用含10％犢牛血清的營養液制成細胞懸液，置25mm細胞培養瓶中，37℃、5％CO₂培養，3-4天細胞長成致密的單層細胞；