[發明專利]一種羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫及構建方法

有效

• 申請號: 201810928386.0
• 申請日: 2018-08-15
• 公開（公告）號: CN108998443B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 陳國華;景志忠;賈懷杰;何小兵;房永祥;宋世斌
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10;C40B50/06;C40B40/08
• 代理公司: 北京高沃律師事務所 11569
• 代理人: 劉奇

1.一種羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫的制備方法，包括以下步驟：

1)制備羊睪丸成纖維細胞；

2)提取羊睪丸成纖維細胞RNA；

3)合成cDNA，進行cDNA文庫均一化；

4)cDNA與pPR3-N載體連接，連接產物轉化宿主細胞DH5α，獲得羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫，并進行克隆驗證；

5)篩選羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫；

所述提取羊睪丸成纖維細胞RNA的方法為將步驟1)所述羊睪丸成纖維細胞培養5-6代后利用Trizol試劑法提取獲得；

所述羊睪丸成纖維細胞的制備方法包括：

1)無菌取出初生健康羊羔羊睪丸，用Hank’s液洗2-3次，剔除鞘膜、白膜后，再沖洗2-3次；

2)將睪丸實質剪成1-2mm大小的組織塊，加入4倍量的0.25％胰酶消化液，于37℃水浴中消化30-40分鐘；

3)用含10％犢牛血清的營養液制成細胞懸液，用碳酸氫鈉調pH至7.0，置25mm細胞培養瓶中，37℃、5％CO₂培養，3-4天細胞長成致密的單層細胞；

4)然后利用PBS洗2次，加1ml胰酶，37℃、5％CO₂放置2min，加入培養基按一定的比例分置其他細胞瓶，如此傳5-6代，細胞生長穩定；

所述cDNA文庫均一化包括雜交處理、DSN消化處理、兩次PCR擴增放大，并對PCR兩次放大進行SfiI消化的步驟；

所述篩選羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫包括構建誘餌載體、鑒定誘餌質粒與篩選羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫。

2.根據權利要求1所述的羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫的制備方法，其特征在于，所述合成cDNA包括反轉錄法合成cDNA第一鏈與LDPCR合成cDNA第二鏈。

3.根據權利要求1所述的羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫的制備方法，其特征在于，所述宿主細胞DH5α為宿主細胞DH5α感受態細胞。

4.根據權利要求1～3任意一項所述的制備方法獲得羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫。

5.根據權利要求4所述的羊睪丸成纖維細胞膜體系酵母cDNA文庫，其特征在于，所述cDNA文庫容量為7.5×10⁵，片段的大小為200-2000bp，平均長度為1000bp，文庫的重組率為100％。