[發明專利]一種可定量可追蹤的測定貽貝粘蛋白降解的方法

在審

• 申請號: 201810925327.8
• 申請日: 2018-08-14
• 公開（公告）號: CN109813911A
• 公開（公告）日: 2019-05-28
• 發明（設計）人: 拉斯·赫爾曼;顧銘;母瑞紅
• 申請（專利權）人: 江陰貝瑞森生化技術有限公司;中國食品藥品檢定研究院
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/60;G01N33/58
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明屬于生物技術領域，涉及一種可定量和可追蹤的貽貝粘蛋白降解研究方法，包括步驟：(1)將貽貝粘蛋白與放射性元素或熒光試劑結合后，通過分子間交聯形成聚合體，或包被在生物醫學材料上固化形成貽貝粘蛋白微球。(2)建立體外和體內模型。(3)利用體內或/和體外模型，定性和定量測定標記物在上清液中的增加以及在貽貝粘蛋白聚合體/包被微球上的減少量，從而確定貽貝粘蛋白在不同環境中的降解特性及降解速率。本發明彌補了生物醫學大分子降解研究方法學的缺失，提供了一種動態、定量的研究方法。

技術領域

本發明涉及醫學生物大分子降解領域，更具體地，涉及用于測定貽貝粘蛋白降解聚合體和使用所述聚合體測定貽貝粘蛋白降解的方法。

背景技術

貽貝粘蛋白(Mussel adhesive protein,MAP)，也稱作貽貝足絲蛋白(Mytilusedulis foot protein,Mefp)，是海洋貝類紫貽貝(Mytilus edulis Linnaeus)、厚殼貽貝(Mytilus coruscus)、翡翠貽貝(Perna viridis)等分泌的一種特殊的蛋白質。貽貝通常成群地附著在海岸邊的礁石上或者輪船的底部，有在近海耐受波浪沖擊的能力。實際上貽貝幾乎可以極其牢固地附著在任何材料的基底上，如金屬、木材、玻璃等。貽貝具有上述特性的主要原因是其足絲腺內可生成并儲存這種特殊的粘蛋白，貽貝通過足絲釋放粘蛋白到巖石一類的固體表面上，形成抗水的結合，從而將自己固定。

目前從貽貝中鑒定得到11種粘蛋白亞類，包括mefp1、mefp-2、mefp-3、mefp-4、mefp-5、mefp-6、pre-COL-P、pre-COL-D、pre-COL-NG、足絲基質蛋白PTMP和DTMP(朱曜曜等，海洋科學進展，2014,32(4)：560-568)。貽貝粘蛋白具有2個結構特點：(1)含有賴氨酸，使蛋白帶有高載量正電荷；(2)含3,4二羥基苯丙氨酸(DOPA，多巴)。人體的細胞和組織帶有負電荷。貽貝粘蛋白通過自身正電荷與人體的細胞和組織負電荷之間的靜電相互作用與細胞和組織緊密結合，發揮防護和治療的作用。此外，多巴氧化生成鄰位二醌，可以和未被氧化的多巴相互交聯形成膜或是網狀支架，促使蛋白質更加緊密、穩固地附著在人體表面，起到保護作用。

貽貝粘蛋白作為一種新型動物源性生物材料，具有來源廣泛、低免疫原性、生物相容性好、易和帶負電荷的細胞發生相互作用等優點，作為新型生物創面敷料已在臨床得到了應用，未來還可用作新型組織工程支架或醫療器械涂層材料等。但目前國內外研究尚不了解貽貝粘蛋白的降解特性和免疫原性，特別是缺少有效的降解研究方法以及缺少降解產物對人體影響的報告，使這類產品在臨床使用上存在潛在的風險。

隨著生物大分子尤其是蛋白質分子在醫療領域中越來越多的應用，有必要建立一種能夠定量測定和表征其在人體使用環境下降解速率和降解特性的方法。

目前，蛋白多肽類體內降解的研究主要集中在藥代動力學研究方面。所研究的藥品大部分屬于全身給藥，很快的被吸收進入血液中達到血藥濃度峰值，然后進入到不同的組織中。研究方法有生物檢定法、同位素標記示蹤法、免疫分析法、液相色譜(LC)、毛細管電泳(CE)、氣相色譜(GC)、質譜(MS)、核磁共振(NMR)、液相色譜-質譜(LC-MS)和毛細管電泳-質譜(CE-MS)聯用技術等。這些方法大部分都需要繁瑣的樣品獲得和處理步驟，而且不能獲得實時的數據。

而醫療器械與藥品不同，大部分都是局部使用，且使用時間較長。因此，其降解研究不同于全身系統用藥，降解過程是一個持續到緩慢過程，降解產物或者只局限在應用部位周圍逐漸被吸收，或者以極低的濃度持續進入血液循環和其他組織。因此，上述方法或者測量精度不夠，不能獲得器械真實使用狀態下的降解情況；或者不能實時原位測量而無法獲得真實的降解數據。因此，對于蛋白類醫療器械的降解過程一直是研究的難點。

發明內容