[發(fā)明專利]一種非病毒載體共表達IL18的CAR-T細胞構建及其應用

在審

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• 申請日: 2018-08-14
• 公開（公告）號: CN108949695A
• 公開（公告）日: 2018-12-07
• 發(fā)明（設計）人: 陳相波;馮煜;雷鳴;田朋飛
• 申請（專利權）人: 杭州榮澤生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/63;C12N15/62;C07K19/00
• 代理公司: 上海精晟知識產權代理有限公司 31253
• 代理人: 馮子玲

本發(fā)明公開了一種共表達IL18的CD19特異性嵌合抗原受體T細胞的制備方法。本發(fā)明通過將含有CD19 CAR和IL18的睡美人質粒轉座系統(tǒng)轉染入T細胞中，同時加入特定劑量的IL2和anti?CD3/CD28磁珠抗體，從而獲得共表達IL18的CD19 CAR?T細胞。所得的T細胞能夠特異性地殺傷腫瘤細胞，同時表達的IL18能夠顯著增加T細胞的殺傷效果。

技術領域

本發(fā)明涉及免疫細胞制備領域，具體地，本發(fā)明涉及一種IL-18共表達于CD19特異性嵌合抗原受體T細胞及其用途。

技術背景

嵌合抗原受體T細胞治療(Chimeric antigen receptor T cell therapy,CAR-Ttherapy)是一種新興的腫瘤免疫治療，該療法是通過對患者體內的T細胞進行改造，在T細胞膜上表達一種腫瘤特異性的嵌合抗原受體(Chimeric antigen receptors,CARs)，使其能夠通過腫瘤特異性的、非MHC分子依賴性的途徑激活，從而發(fā)揮抗腫瘤作用。CAR是一種跨膜受體，主要由胞外識別結構域、跨膜區(qū)和胞內激活結構域組成，其胞外識別結構域通常為腫瘤細胞特征性表面分子的單鏈抗體(single-chain variable fragment,scFv)，胞內激活結構域為T細胞受體(T cell receptor,TCR)的CD3ζ，當CAR胞外的單鏈抗體與腫瘤細胞識別、結合，即可激活CD3ζC，進而直接激活T細胞。

至今已發(fā)展出三代CAR，其中第二代CAR是研究最多、最具應用前景，第二代CAR分子在跨膜區(qū)和激活結構域之間還偶聯(lián)了一個T細胞共刺激分子，如CD28、4-1BB等，在共刺激分子的協(xié)同作用下，CAR-T細胞表現出更持久的增殖能為和更強的抗腫瘤功能。

近年來，改造CAR-T細胞使其表達某些細胞因子，可對CD8+T細胞的功能、生存和分化有促進作用，這些因子包括IL-12、IL-15、IL-7和IL21等，如在CAR分子上偶聯(lián)某種細胞因子如IL-15，使細胞因子與CAR共表達于T細胞，也能顯著提高T細胞的體內、體外生存和殺傷靶細胞的能力。與外源性細胞因子相比，CAR-T細胞共表達的細胞因子只作用于腫瘤局部微環(huán)境，無血液稀釋的影響，并且不會對正常組織帶來副作用。

細胞因子IL18是一種具有抗腫瘤活性的蛋白質，IL-18可作用于T、B以及NK細胞等效應細胞的增殖與分化，促進IFN-γ的表達和克里梅的釋放，從而發(fā)揮其抗腫瘤功能。IL-18和IL12也可直接作用于CD8+T細胞和NK細胞，誘導其產生更多的IFN-γ、釋放顆粒酶B、表達FasL，從而進一步殺傷腫瘤細胞。同時，IL18因其相對低毒的特性以及和傳統(tǒng)療法的的協(xié)同作用引人注目。

目前，將細胞整合進T細胞的方式包括病毒載體和非病毒載體兩種方式。其中病毒載體雖然可以較高的拷貝數整合入宿主細胞基因組，但病毒載體的制備具有一定難度，特別是大規(guī)模制備；且慢病毒也有安全性的潛在風險。睡美人轉座子(Sleeping Beaut,SB)作為表達非病毒載體結構簡單，操作容易，能插入大片段核酸序列，并且成本相較慢病毒很低。有研究表明，SB介導的基因修飾T細胞能在體外擴增2,200至2,500倍，CAR表達率可達84％，未發(fā)現有整合熱點存在，說明SB轉座子/轉座酶系統(tǒng)極具CAR-T細胞的臨床應用潛力。

發(fā)明內容

本發(fā)明要解決的技術問題是，通過將含有CD19 CAR和IL18的睡美人質粒轉座系統(tǒng)轉染入T細胞中，同時加入特定劑量的IL2和anti-CD3/CD28磁珠抗體，從而獲得共表達IL18的CD19 CAR-T細胞，并證明其在實體瘤治療中的潛在應用。具體的說，本發(fā)明提供一種共表達IL18的CD19 CAR-T細胞的構建方法，并賦予T細胞殺傷帶有CD19靶點腫瘤細胞的能力。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采取的技術方案是：