[發明專利]一種完整蛋白質組高pH反相色譜高通量預分離方法

在審

• 申請號: 201810922316.4
• 申請日: 2018-08-14
• 公開（公告）號: CN109001363A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 鐘進強;田志新
• 申請（專利權）人: 同濟大學
• 主分類號: G01N30/89
• 分類號: G01N30/89
• 代理公司: 上?？剖⒅R產權代理有限公司 31225
• 代理人: 褚明偉

本發明涉及一種完整蛋白質組高pH反相色譜高通量預分離方法。完整蛋白質組高pH反相色譜高通量預分離方法，其特征在于，加入蛋白質混合物于SPE柱，所述蛋白質混合物與SPE柱中的反相色譜填料混合，SPE柱中依次加入不同極性的洗脫液，利用注射器將不同極性的洗脫液排出SPE柱得到溶解了不同蛋白的餾分，離心管接收餾分。與現有技術相比，與現有技術相比，本發明方法操作簡單、快速、通量高。

技術領域

本發明涉及蛋白質預分離研究領域，尤其是涉及一種完整蛋白質組高pH反相色譜高通量預分離方法。

背景技術

蛋白質的預分離技術，在蛋白質組學的研究中具有重要的意義。在蛋白質組學中利用正交分離的方法可以提高蛋白質分析的動態范圍和蛋白質鑒定的覆蓋率。Yang F等人(Yang F,Shen Y,Camp D G,et al.High-pH reversed-phase chromatography withfraction concatenation for 2D proteomic analysis[J].Expert Review ofProteomics,2012,9(2):129-34.)建立了以高pH反相色譜預分離，以低pH反相色譜作為最后一維對蛋白樣品進行了分離研究，并將這種分離模式與離子交換-反相色譜分離模式進行了對比；結果發現，高-低pH反相色譜分離模式的分離效果優于離子交換-反相色譜分離模，高pH條件下的反相色譜預分離可以有效地代替離子交換色譜預分離。Wang Z等人(WangZ,Ma H,Smith K,et al.Two-Dimensional Separation Using High pH and Low pHReversed Phase Liquid Chromatography for Top-down Proteomics[J].InternationalJournal of Mass Spectrometry,2017,427.)利用規格為(3.5μm,2.1mm×250mm)的C4色譜柱，用高pH和低pH高效液相反相色譜聯用的二維離線分離方法，對整體大腸桿菌蛋白進行了預分離和分離研究，該方法的上樣量為50μg，同時該研究還對高pH和低pH的反相色譜分離的正交性進行了研究，研究結果顯示聯用兩種方法后蛋白質的鑒定數量明顯提高。

上述的研究表明高pH和低pH分離聯用的二維分離方法具有良好的正交性。兩種分離方法的聯用能顯著的提高蛋白質的鑒定數量。目前，對于高pH條件下整體蛋白的反相色譜分離有了一定的研究；但是大多都是基于商業色譜柱或自制的毛細管色譜柱等在線或離線的分離方法；這些分離方法處理樣品的通量低，分離速度相對較慢，當面對大量的樣品時比較耗時。為此，蛋白質的預分離需要一種高通量快速的方法，來增加蛋白質預分離的通量和分離速度。

專利CN 105890960 A使用尺寸排阻色譜填料、反相色譜填料或離子交換色譜填料作為固定相填料，將固定相填料與蛋白質混合物混合后，加入不同強度的洗脫緩沖夜，充分混合并離心處理，收集洗脫緩沖液。基于蛋白質混合物中不同性質的蛋白質被分別收集到不同強度的洗脫緩沖液中，實現完整蛋白質混合物的預分離。該方法的速度較快，但是該方法分離方法中，得到的部分蛋白質餾份中含有鹽，需要離線除鹽，除鹽過程中會造成大量蛋白質的損失，同時需要離心等復雜的操作，由于餾份和填料都在同一個離心管中，這使得部分餾份殘留或吸取餾份時容易吸到填料，而殘留的餾份會混入到下一個餾份的組分里，會導致預分離效果變差，而吸出的填料會增加餾份預處理的難度。

發明內容

本發明的目的就是為了克服上述現有技術存在的缺陷而提供一種完整蛋白質組的高通量預分離方法。

本發明的目的可以通過以下技術方案來實現：

一種完整蛋白質組高pH反相色譜高通量預分離方法，加入蛋白質混合物于SPE柱，所述蛋白質混合物與SPE柱中的反相色譜填料混合，SPE柱中依次加入不同極性的洗脫液，利用注射器將不同極性的洗脫液排出SPE柱得到溶解了不同蛋白的餾分，離心管接收餾分。