[發明專利]食用肉類鑒別陽性對照品及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201810922068.3
• 申請日: 2018-08-14
• 公開（公告）號: CN108977552A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 艾金霞;孫麗媛;高麗君;李明成;周亭亭;王艷雙;張麗華;段思琪;劉玟妍
• 申請（專利權）人: 北華大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6806
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 李海恬;李小林

本發明涉及一種食用肉類鑒別陽性對照品及其制備辦法和應用，屬于PCR鑒別技術領域。該對照品的制備方法包括以下步驟：S1擴增：取經確證的牛、羊、豬、雞、鴨和驢肉中的至少一種，分別用對應的引物對進行PCR擴增，以瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果，分別回收特異性DNA條帶；S2純化：上述特異性DNA條帶以吸附柱進行純化；S3連接：純化DNA產物與載體進行連接；S4轉化：連接產物分別轉化至大腸桿菌感受態細胞，獲得轉化細菌；S5培養：轉化細菌涂板培養后進行陽性克隆菌落的篩選，挑取陽性菌落進行擴增，即得陽性對照品。上述食用肉類鑒別陽性對照品與常規肉類鑒別時采用的經鑒定陽性對照品相比，具有DNA信息明確、穩定、便于保存的優點，可作為標準物質使用。

技術領域

本發明涉及DNA鑒別技術領域，特別是涉及一種食用肉類鑒別陽性對照品及其制備方法和應用。

背景技術

自1987年英國首先發生瘋牛病以來，世界各國和地區都先后頒布了法律和法規以控制動物源性成分的使用。2013年初，一些歐洲國家卷入“馬肉風波”丑聞后，引起各國對肉及肉制品摻假問題的關注。

目前國內市場上存在較為嚴重的肉類摻假現象，其中牛羊肉的摻假情況最為突出。常見的是用豬肉摻假牛肉和羊肉，用鴨肉和牛肉摻假羊肉等。巨大的價格差異，是不法商販摻雜摻假的經濟動因。伴隨肉類食品摻假的手段和花樣不斷地翻新所產生的商業欺詐、市場亂象、貿易糾紛等問題同樣不容忽視。普通消費者難以通過感官分辨摻假肉，即使是執法部門在取證過程中目前也缺乏簡便有效的技術手段，對摻假肉打擊乏力是肉類摻假愈演愈烈的技術原因。基于食品安全性與質量監督的需要，有必要對常見食用肉成分進行檢測。

傳統方法對常見食用肉成分種源的鑒定主要依賴于感官和形態學檢驗。感官檢驗準確度低，局限性大，對加工過的摻假樣品基本無法鑒別。所以，一套科學、快速、準確、高通量的篩選方法將會為檢測和執法人員提供強大的技術支撐。

目前國內外在肉類食品檢測上普遍采用化學分析方法、紫外光譜分析等方法，上述方法在肉類食品檢驗中存在著特異性不強、操作繁瑣、費用高等弊端，難以滿足對肉類食品鑒定的要求。其他被廣泛報道的檢測手段還有紅外光譜技術、色譜技術、酶聯免疫分析技術及DNA檢測技術等。

近紅外光譜檢測技術是在近紅外光波長范圍內對肉類中的蛋白質、核酸、脂肪等化合物中大量的含氫基團進行檢測，主要應用于肉類成分鑒別、品質鑒別以及真偽鑒別。國外已經有相關報道。Ding等利用近紅外光譜分別檢測了袋鼠肉和牛肉，并建立了多元性回歸模型區分袋鼠肉和牛肉。Morsy等利用近紅外光譜對新鮮和解凍的牛肉進行了定量檢測，發現其檢測相關系數和標準偏差均有差異。近紅外光譜檢測技術具有快速、制樣簡單、同時測定多組分和無污染的特性，但因成本比較高，需建立分析模型，在線檢測精度不高等，有待進一步研究。

色譜分析主要是對肉類氨基酸、蛋白質、肽類等成分的分析而鑒定其種類。Giaretta等利用陽離子交換色譜檢測豬肉和牛肉的肌紅蛋白，通過色譜譜圖上的差異區分豬肉和牛肉的分離組分，以色譜峰面積變化識別牛肉中摻入豬肉成分含量。色譜分析檢測限低，定量更準確，應用范圍更廣泛，但成本較高。利用色譜技術進行肉類鑒別起步較晚，但近年來隨著高分辨色譜儀器的出現，利用色譜技術鑒定物種已經成為新的熱點。

早在1980年代，就有學者將酶聯免疫分析方法應用于肉類鑒別測試當中。Kangethe等利用酶聯免疫反應鑒別馬肉和牛肉。Rencova等利用ELISA方法鑒別了家禽、馬、袋鼠等肉類。目前國外的一些公司已經研發出利用利用酶聯免疫分析檢測肉類的儀器，但肉類加工過程中，蛋白質易變性而使酶聯免疫反應失效，所以ELISA方法只適合于未加工過的肉制品，應用范圍相對較窄。