[發明專利]食用肉類鑒別陽性對照品及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 201810922068.3
• 申請日: 2018-08-14
• 公開（公告）號: CN108977552A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 艾金霞;孫麗媛;高麗君;李明成;周亭亭;王艷雙;張麗華;段思琪;劉玟妍
• 申請（專利權）人: 北華大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6806
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 李海恬;李小林

1.一種食用肉類鑒別陽性對照品的制備辦法，其特征在于，包括以下步驟：

S1擴增：取經確證的牛、羊、豬、雞、鴨和驢肉中的至少一種，分別用下述對應的引物對進行PCR擴增；

牛：上游引物：5'-TCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'

下游引物：5'-GAAAAGTGTAAGACCCGTAATATAAG-3'

羊：上游引物：5'-TCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'

下游引物：5'-TATGAATGCTGTGGCTATTGTCGCA-3'

豬：上游引物：5'-TCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'

下游引物：5'-GCTGATAGTAGATTTGTGATGACCG-3'

雞：上游引物：5'-TCCATCAAACATCTCATCTTGATGAAA-3'

下游引物：5'-GATACAGATGAAGAAGAATGAGGCG-3'

鴨：上游引物：5'-GGCTTCTACTACGGCTCCTA-3'

下游引物：5'-TCTGGTTTGATGTGTGGTGG-3'

驢：上游引物：5'-TCGAATGAATCTGAGGTGGA-3'

下游引物：5'-ACATGTGTAGGGTAGGGATG-3'

取上述PCR產物，以瓊脂糖凝膠電泳分析擴增結果，分別回收牛、羊、豬、雞、鴨和驢肉的特異性DNA條帶；

S2純化：取上述獲得的特異性DNA條帶，以吸附柱進行純化，分別得牛、羊、豬、雞、鴨和驢肉的純化DNA產物；

S3連接：取上述獲得得純化DNA產物與載體進行連接；

S4轉化：將上述連接產物分別轉化至大腸桿菌感受態細胞，獲得轉化細菌；

S5培養：將上述轉化細菌涂板培養后進行陽性克隆菌落的篩選，挑取陽性菌落進行擴增，提取質粒，電泳鑒定得到特異性條帶，即得陽性對照品。

2.根據權利要求1所述的食用肉類鑒別陽性對照品的制備辦法，其特征在于，所述S1擴增步驟中，牛的特異性DNA條帶為254±10bp的條帶，羊的特異性DNA條帶為317±10bp的條帶，豬的特異性DNA條帶為379±10bp的條帶，雞的特異性DNA條帶為207±10bp的條帶，鴨的特異性DNA條帶為512±10bp的條帶，驢的特異性DNA條帶為447±10bp的條帶。

3.根據權利要求1所述的食用肉類鑒別陽性對照品的制備辦法，其特征在于，所述S2純化的具體步驟為：

溶解膠塊：將目的DNA條帶從瓊脂糖凝膠中切下，加入PN溶液溶解膠塊，得膠塊溶液；

過柱：將膠塊溶液上樣至吸附柱CA2中，以PW液進行漂洗，晾干；向吸附柱CA2的吸附膜滴加ddH₂O，收集洗脫的DNA液體；或向吸附柱CA2的吸附膜滴加洗脫緩沖液EB，收集洗脫的DNA液體。

4.根據權利要求1所述的食用肉類鑒別陽性對照品的制備辦法，其特征在于，所述S3連接步驟中，所述載體為pGM-T載體，且所述DNA產物與載體的摩爾比為3-5:1。

5.根據權利要求1所述的食用肉類鑒別陽性對照品的制備辦法，其特征在于，所述S4轉化的具體步驟為：將連接產物加入到DH5α大腸桿菌感受態細胞中混勻，冰浴后熱休克，再放置于冰上冷休克；再加入SOC培養基，恒溫培養，得轉化細菌液。

6.根據權利要求5所述的食用肉類鑒別陽性對照品的制備辦法，其特征在于，所述S5培養的具體步驟為：將x-gal和IPTG混勻后點狀滴于LB培養基上，均勻涂抹，避光室溫放置；將上述轉化細菌液離心后棄去上清液，將剩余轉化細菌液混勻后滴加于LB固體培養基上，均勻涂開，恒溫培養；挑取白色陽性菌落進行擴增，將該白色陽性菌落加入LB液體培養基中，并加入Amp后恒溫振蕩培養，得擴增菌落，即為陽性對照品。

7.權利要求1-6任一項所述的食用肉類鑒別陽性對照品的制備辦法制備得到的陽性對照品。