[發明專利]OPCML基因啟動子甲基化水平的檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201810921094.4
• 申請日: 2018-08-14
• 公開（公告）號: CN109097468A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 周峰;曹興建;陳相
• 申請（專利權）人: 南通市第一人民醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 梁金娟

本發明提供一種OPCML基因啟動因子甲基化水平的檢測試劑盒，包括以下物質：(a)酶切反應液(10μL/測試)，包括雙蒸水7μL，10×Buffer R 2μL，Bsh1236I 1μL；(b)OPCML基因的引物及探針組；(c)PCR工作液；(d)標準品1?5，濃度分別為7.0×10⁷copies/mL、7.0×10⁶copies/mL、7.0×10⁵copies/mL、7.0×10⁴copies/mL、7.0×10³copies/mL。利用本發明的試劑盒及MSRE結合MNAzyme qPCR技術，可快速、準確地檢測出卵巢癌患者外周血中OPCML基因啟動子甲基化水平。

技術領域

本發明涉及一種OPCML基因啟動子甲基化水平的檢測試劑盒及其應用，尤其用于MSRE結合MNAzyme qPCR檢測卵巢癌患者外周血中OPCML基因啟動子甲基化水平。

背景技術

目前，卵巢癌發病率位居女性生殖系統惡性腫瘤第三位，病死率居第一位，占所有因癌癥死亡女性患者的3％。卵巢癌90％以上為上皮性卵巢癌，發病隱匿，臨床確診時約80％患者疾病已為晚期，預后差。晚期卵巢癌(FIGOⅡ-Ⅳ期)患者5年生存率僅為30～45％，而早期卵巢癌(FIGOⅠ期)患者5年生存率高達90％以上。因此，除積極尋找新的有效的治療方式外，探討卵巢癌發生發展的生物學機制，研發新型卵巢癌早期診斷技術迫在眉睫。

現有技術中尚無簡便有效的、精確的、可常規用于卵巢癌早期診斷的檢測方法。CA125是目前普遍使用的卵巢癌標志物，但僅有50～60％的I期卵巢癌患者CA125水平升高，且其他疾病如卵巢子宮內膜異位囊腫等亦可引起CA125水平升高，故其敏感性和特異性較差，卵巢癌陽性預測值僅有10％～35％。總體而言，對于血清CA125檢測、經陰道超聲探查等傳統的早期診斷方法單一或聯合應用，目前均無證據顯示可降低人群的卵巢癌發病率和(或)病死率。其主要原因在于這些方法的假陰性或假陽性率均過高，敏感性和特異性達不到臨床需要。

DNA甲基化是一項重要的表觀遺傳學機制，在人類癌癥發生發展中發揮著重要的作用。特定基因的啟動子區甲基化異常引起了人們的廣泛關注，被認為是癌癥診斷的潛在標志物。在癌癥中只有極少數的單獨基因被證明是甲基化比例很高的。因此，檢測一組基因的甲基化狀態，與檢測單獨基因的甲基化狀態相比，診斷靈敏度更高、特異性更好。目前研究已證實原發性卵巢癌可有多種抑癌基因的甲基化，提示卵巢癌顯示出CpG島甲基化表征。作為癌癥發生的早期事件，抑癌基因DNA異常甲基化檢測可以在患者出現臨床表現或者影像學證據之前做到分子診斷，為卵巢癌的早期診斷提供了新的途徑。

目前，研究已證實癌癥患者血清富含腫瘤DNA(Serum free circulating DNA，SfcDNA)，可用于癌癥分子生物學診斷。使用體液標本(血清、尿液等)檢測其中游離腫瘤特異DNA在其他癌癥如肺癌、頭頸部腫瘤、前列腺癌等已被證實可行。更為重要的是，腫瘤游離DNA不僅在晚期轉移癌癥患者血清內存在，對于早期患者，血清內同樣可檢測到腫瘤游離DNA，研究認為其來源于侵入體內循環但無浸潤機體實質器官能力的腫瘤細胞，或是由凋亡腫瘤細胞釋放進入體內循環。因此，利用血清游離DNA(SfcDNA)進行癌癥的早期分子生物學診斷是當前研究的一大熱點。

雖然國內外研究者利用卵巢癌患者血清游離DNA甲基化檢測，在卵巢癌早期診斷中的研究取得了令人振奮的進步，但是在實際操作過程中存在以下局限性：1、血清游離DNA微量(正常人濃度平均為：0.03ug/ml，腫瘤患者濃度平均為0.18ug/ml)，并且多以小片段形式存在，大大增加了提取的難度，降低了臨床檢測的敏感性和特異性；2、目前DNA甲基化的主要研究方法為甲基化特異性PCR(Methylation Specific PCR,MSP)，其操作繁瑣，DNA經亞硫酸氫鹽修飾后丟失嚴重，一般只用于單個基因檢測，特異性和敏感性均較低；3、卵巢癌抑癌基因失活的不確定性及血清游離DNA的局限性，導致單一卵巢癌甲基化標記物檢測無法滿足臨床要求。

發明內容