[發明專利]OPCML基因啟動子甲基化水平的檢測試劑盒及其應用

在審

• 申請號: 201810921094.4
• 申請日: 2018-08-14
• 公開（公告）號: CN109097468A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 周峰;曹興建;陳相
• 申請（專利權）人: 南通市第一人民醫院
• 主分類號: C12Q1/6886
• 分類號: C12Q1/6886;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 北京科家知識產權代理事務所(普通合伙) 11427
• 代理人: 梁金娟

1.一種OPCML基因啟動因子甲基化水平的檢測試劑盒，其特征在于，包括以下物質：

(a)酶切反應液(10μL/測試)，包括雙蒸水7μL，10×Buffer R 2μL，Bsh1236I 1μL；

(b)OPCML基因的引物及探針組，序列為：

其中：序列中大寫字母為DNA序列，小寫字母為RNA序列；

(c)PCR工作液

；

(d)標準品1-5，濃度分別為7.0×10⁷copies/mL、7.0×10⁶copies/mL、7.0×10⁵copies/mL、7.0×10⁴copies/mL、7.0×10³copies/mL。

2.一種如權利要求1所述的OPCM基因啟動因子甲基化水平的檢測試劑盒的使用方法，其特征在于，包括如下步驟：

(A)取患者血清10μL加入到酶切反應液中，輕輕混勻后37℃孵育16小時，標準品與血清同步處理；

(B)取上述酶切DNA 5μL加入到PCR工作液中，進行PCR檢測；

(C)結果判斷：根據標準曲線自動計算未知標本的相應基因拷貝濃度，若發現有標本Ct值小于15，須將其剔除此次結果分析，該標本稀釋后再測直至其Ct值大于15。

3.一種如權利要求1所述的OPCM基因啟動因子甲基化水平的檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)亞硫酸氫鹽處理后測序法檢測卵巢癌組織中OPCML基因啟動子的甲基化狀態，具體為：

(1-1)取卵巢癌組織標本20-25mg，用剪刀剪碎后放入1.5mL的離心管中，利用DNA抽提試劑盒抽提組織樣本中的DNA，抽提的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測DNA的濃度和純度，利用DNA修飾試劑盒修飾提取后的DNA，然后把修飾后的DNA溶解在20μLBuffer TE中；

(1-2)引物系列為：

上游引物5'-GTTTTTTTTGTAGG-GGAAGT-3'，

下游引物5'-CAACAACTCCATCCCTAACC-3'，產物長度243bp；

對修飾后的DNA進行PCR擴增，反應體系25μL，包括：

修飾后的DNA 2μL，10×Buffer 2.5μL，2.5mmol/L dNTP 2μL，25mmol/L MgCl₂ 1μL，10μmol/L上游引物0.5μL，10μmol/L下游引物0.5μL，5U Taq酶0.2μL，無菌蒸餾水16.3μL；

循環條件：

(1-3)利用PCR產物膠純化試劑盒對步驟(1-2)取得的PCR產物進行純化，純化后的PCR產物與質粒連接，轉化到感受態細菌中進行藍白斑篩選，挑取10個白色陽性克隆進行測序，對測序結果與基因組序列進行比對，分析OPCML基因啟動子的甲基化狀態；

(2)根據步驟(1)的分析結果確定擴增位置及設計引物，引物及探針系列包括：

；

(3)選取OPCML基因啟動子甲基化陽性樣本，制備標準品

(3-1)在步驟(1-3)的測序確定陽性的標本中選取1個組織進行DNA提??；

(3-2)將步驟(3-1)提取的DNA進行瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度法檢測DNA的濃度和純度；

(3-3)對步驟(3-2)提取的DNA進行PCR擴增，引物為OPCML-F和OPCML-R，反應體系為：

反應參數為：

(3-4)利用PCR產物膠純化試劑盒，對步驟(3-3)得到的PCR產物進行純化；

(3-5)步驟(3-4)所得純化產物與PGEM-T Easy Vector連接，將連接后的產物轉染到DH5α細胞中，方法同步驟(1-3)，然后選取白色克隆產物進行測序，確定測序后的陽性克隆產物的序列與目標基因一致；

(3-6)質粒提取，然后將質粒DNA用無菌蒸餾水稀釋20倍，然后用紫外分光光度計測OD260，通過OD260和分子量計算拷貝數：

copies/mL＝(6.02×10²³copies/mol)×(濃度g/mL)/(MW g/mol)；

對已知拷貝數標準品進行倍比稀釋，形成6個梯度：7.0×10²-7.0×10⁷copies/mL；

(4)甲基化敏感的限制性內切酶MSRE酶切處理DNA樣本，酶切體系為：

輕輕混勻后37℃孵育16h；

(5)MNAzyme qPCR擴增步驟(4)中酶切后的DNA樣本，反應體系為：

(6)MSRE MNAzyme qPCR的線性范圍、特異性、靈敏度及重復性實驗

(6-1)線性范圍：以步驟(3)制備的6個標準品進行MSRE MNAzyme qPCR，確定其線性范圍；

(6-2)特異性：以陽性標本和陰性標本進行PCR擴增，用擴增曲線的狀態判斷特異性；

(6-3)靈敏度：用已知拷貝數的標準品，進行倍比稀釋，能夠擴增出曲線的最低檢測限，判斷靈敏度；

(6-4)重復性：選取一個已知拷貝數的標準品，進行PCR擴增，分別在同一時間內擴增8次進行批內重復性測定，在不同的時間內擴增8次進行批間重復性測定；

(7)用MSRE MNAzyme qPCR法檢測卵巢癌患者血清中OPCML基因啟動子甲基化水平

檢測臨床標本血清，用甲基化敏感的限制性內切酶BstUI酶切，酶切體系為：

輕輕混勻后37℃孵育16小時；

MNAzyme qPCR：上述酶切后DNA作為模板，反應體系為：

反應參數為：

檢測多例卵巢癌患者血清的OPCML基因甲基化水平，并進行統計學分析。