[發明專利]一種快速篩選多態性微衛星位點目標引物的方法及引物

在審

• 申請號: 201810921068.1
• 申請日: 2018-08-14
• 公開（公告）號: CN108998553A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 李文清;解孝滿;趙鵬;王磊;袁曉鶯;仝伯強;劉鵾
• 申請（專利權）人: 西北大學;山東省林木種質資源中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 孫雅靜

1.一種胡桃屬植物多態性微衛星位點擴增引物，其特征在于，所述引物的正向引物序列為F：TCCACCTAAGTGAGGGCTTG；反向引物序列為R：GAGTGGTGGTGGAGGATGAT。

2.一種快速篩選多態性微衛星位點目標引物的方法，其特征在于，對待篩選的植物進行RNA提取，所述的RNA進行de novo測序后得到轉錄本序列，然后將每個轉錄本序列聚類分析結果最長的一個轉錄本序列作為Unigenes，對得到的Unigenes進行微衛星位點識別后進行引物設計得到EST-SSR，對EST-SSR進行數據處理、PCR擴增篩選得到多態性微衛星位點目標引物；

所述的數據處理包括：

(1)將EST-SSR根據引物PCR擴增產物片段大小進行降序排列，并將未設計引物的EST-SSR數據刪除；

(2)再根據堿基重復類型進行EST-SSR降序排列后，將堿基重復類型為單堿基重復且堿基重復次數小于18的EST-SSR刪除；

(3)根據EST-SSR堿基重復單元總數進行降序排列，刪除堿基重復單元總數小于60的序列；

(4)根據EST-SSR引物PCR擴增產物片段大小進行升序排列，刪除擴增產物片段大小在140bp以下并且堿基重復單元總數小于20的引物序列；

(5)根據堿基重復單元總數按照降序進行排列，刪除堿基重復單元總數小于18的引物序列；

(6)然后根據堿基重復單元總數按照降序進行排列，再刪除堿基重復類型為Pc的堿基序列；

(7)依次以引物PCR擴增產物大小和堿基重復單元總數對EST-SSR進行降序排列，保留總序列數目中的位于前50％的引物序列為初篩序列；

(8)在初篩序列中選取產物片段長度為142-280bp的引物；按10bp為分組標準，產物片段長度是142-280bp的每個長度段均保證對應五對引物，通過PCR擴增篩選即得多態性EST-SSR引物。

3.根據權利要求2所述的快速篩選多態性微衛星位點目標引物的方法，其特征在于，對胡桃屬植物的葉片、芽和/或果實進行RNA的提取，對所述的RNA進行de novo測序后得到轉錄本序列，然后把每個轉錄本序列聚類分析結果中最長的一個轉錄本序列作為Unigenes，對得到的Unigenes進行微衛星位點識別后進行引物設計得到EST-SSR，對EST-SSR進行數據處理、PCR擴增篩選得到胡桃屬多態性微衛星位點目標引物。

4.根據權利要求2所述的快速篩選多態性微衛星位點目標引物的方法，其特征在于，利用Illumina Hiseq對提取得到的RNA進行高通量測序后得到原始reads，原始reads經如下處理后得到clean reads；再對clean reads進行de novo組裝，得到轉錄本序列；

(1)去除不確定堿基比例占總堿基數的5％以上的reads；

(2)去除質量值Q≤10的堿基數達整條序列20％以上的reads；

(3)去除含測序接頭的reads。

5.根據權利要求4所述的快速篩選多態性微衛星位點目標引物的方法，其特征在于，使用Trinity對得到的clean reads進行de novo組裝，得到轉錄本序列，然后把每個轉錄本序列聚類分析結果中最長的一個轉錄本序列作為Unigenes；

通過MISA腳本http://pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html對Unigenes進行微衛星位點識別。

6.根據權利要求2所述的快速篩選多態性微衛星位點目標引物的方法，其特征在于，所述的引物設計采用http://primer3.sourceforge.net/releases.php設計引物，然后進行設計得到的引物的多態性擴增；控制產物片段長度為142-280bp；按10bp為分組標準，產物片段長度是142-280bp的每個長度均保證對應五對引物；即得EST-SSR引物；

引物設計參數：核苷酸長度為18bp-23bp，擴增產物大小為142-280bp，最適退火溫度為58℃，GC含量為50％-60％。

7.一種引物，其特征在于，所述的引物采用權利要求2-6任一權利要求所述的快速篩選多態性微衛星位點目標引物的方法篩選得到。