[發明專利]一種快速篩選多態性微衛星位點目標引物的方法及引物

在審

• 申請號: 201810921068.1
• 申請日: 2018-08-14
• 公開（公告）號: CN108998553A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 李文清;解孝滿;趙鵬;王磊;袁曉鶯;仝伯強;劉鵾
• 申請（專利權）人: 西北大學;山東省林木種質資源中心
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12N15/11
• 代理公司: 西安恒泰知識產權代理事務所 61216
• 代理人: 孫雅靜

本發明公開了一種快速篩選多態性微衛星位點目標引物的方法及引物，所述的方法可用于篩選多態性好、穩定性高的EST?SSR分子標記引物，進而后續對該屬植物進行群體遺傳和適應進化方面的研究。本發明在胡桃屬物種轉錄組數據分析過程中，設計開發的EST?SSR多態性微衛星位點并從開發的33?77對EST?SSR引物中篩選出12?39對多態性好且穩定性高的EST?SSR引物，條帶清晰、能100％擴增，可靠性強，只需常規PCR擴增，聚丙烯酰胺凝膠電泳及毛細管測序儀即可完成對該分子標記的快速篩選。開發的雙親遺傳且與基因功能相關的EST?SSR分子標記，可作為胡桃屬群體遺傳多樣性和適應進化研究的引物，可為進一步遺傳圖譜構建、基因定位及分子輔助育種等研究提供科學依據。

技術領域

本發明屬于植物分子生物技術領域，涉及一種快速篩選多態性微衛星位點目標引物的方法及引物。

背景技術

EST-SSR是基于表達序列標簽開發微衛星的一種新型分子標記，與基因組SSR相比，EST-SSR具有在植物物種之間可轉移性的優點。目前，EST-SSR被廣泛應用于植物基因組學研究如遺傳圖譜構建、比較作圖、遺傳多樣性評價、種質鑒定、系統發育與進化研究等方面。傳統基因組SSR標記開發費時、費力、且成本較高，需要投入大量的人力物力。而基于轉錄組數據，通過搜索SSR的EST-SSR標記開發具有穩定性高、通用性好、成本低、開發簡單快捷等特點而備受關注。因為一些轉錄組微衛星標記可以轉移到一些相關分類中，他們可以被有效用于群體進化分析、群體遺傳研究和比較定位中，EST-SSRs數據不僅可開發功能，RNA-seq對于罕見轉錄本、多樣化拼接和細胞中基因表達水平都有潛在的恢復作用，此外，采用高通量測序的方法對胡桃屬物種豐富的遺傳資源進行EST-SSR分子標記的開發篩選及遺傳多樣性研究，有利于特異資源的挖掘、分子標記輔助育種提供技術指導，有助于理解植物進化與適應。另外，在轉錄組數據分析的基礎上開發EST-SSR引物，從中篩選多態性高、穩定性好的標記，這對胡桃屬物種種質資源的保護具有重要的意義。

在引物開發方面，雖然胡桃屬物種已開展一些基于分子標記的遺傳研究，但主要是采用SSR、RAPD、ISSR、AFLP標記技術進行遺傳多樣性和品種鑒別等方面的研究(陳少瑜等2006，2011)，尤其在GenBank中有關于泡核桃的基因組資源只有17條核苷酸序列和181個蛋白序列。在泡核桃基因組DNA中并未出現微衛星位點的資料記載，所有關于泡核桃的研究(Wang et al.2015；Gunn et al.2010)受到了可利用的多態性標記數目及不存在可利用的ESTs(expressed sequence tags)標簽的限制。尤其是通過轉錄組測序，表達功能基因注釋等技術，進行泡核桃特異EST-SSR引物的開發還很有限，目前國內外均未見文獻報道。

發明內容

針對現有技術中的缺陷和不足，本發明給出了一種快速篩選多態性微衛星位點目標引物的方法及引物，解決了現有技術中缺乏快速篩選胡桃屬植物EST-SSR分子標記方法的問題。同時得到了引物，該引物的擴增穩定性和多態性良好。

為解決上述問題，本發明采取的技術方案為：

一種胡桃屬植物多態性微衛星位點擴增引物，所述引物的正向引物序列為F：TCCACCTAAGTGAGGGCTTG；反向引物序列為R：GAGTGGTGGTGGAGGATGAT。

一種快速篩選多態性微衛星位點目標引物的方法，對待篩選的植物進行RNA提取，所述的RNA進行de novo測序后得到轉錄本序列，然后把每個轉錄本序列聚類分析結果中最長的一個轉錄本序列作為Unigenes，對得到的Unigenes進行微衛星位點識別后進行引物設計得到EST-SSR，對EST-SSR進行數據處理、PCR擴增篩選得到多態性微衛星位點目標引物；

所述的數據處理包括：

(1)將EST-SSR根據引物PCR擴增產物片段大小進行降序排列，并將未設計引物的EST-SSR數據刪除；