[發明專利]外周血單個核細胞誘導的記憶性免疫細胞及應用

在審

• 申請號: 201810919520.0
• 申請日: 2018-08-14
• 公開（公告）號: CN109082410A
• 公開（公告）日: 2018-12-25
• 發明（設計）人: 路春光
• 申請（專利權）人: 路春光
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N15/867;A61K35/17;A61P35/00;A61P31/12;A61P31/18;A61P31/06
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本發明涉及免疫細胞靶向治療技術領域，特別涉及一種人體外周血單個核細胞誘導分化為記憶性免疫細胞，冷凍的外周血單個核細胞誘導的TCM細胞應用于臨床腫瘤治療提供了基礎，可根據腫瘤患者的治療方案隨時復蘇細胞，解決了腫瘤患者T細胞增殖能力差和免疫無能問題；目前回輸的免疫細胞尤其是克隆化效應T細胞在體內難以長期存活，極大的影響了過繼性細胞治療的臨床療效。記憶性T細胞具有長效記憶性，通過TCR基因轉染TCM，賦予TCM細胞靶向性。

技術領域

本發明涉及免疫細胞靶向治療技術領域，特別涉及一種人體外周血單個核細胞誘導分化為記憶性免疫細胞（TCM），還涉及記憶性免疫細胞（TCM）的應用。

背景技術

過繼性細胞治療技術為打破腫瘤患者中樞和外周免疫耐受，恢復或增強其抗腫瘤免疫功能提供了一種有效的方法。然而目前還存在不少問題亟待解決，包括：1)如何獲得充分數量的腫瘤反應性T細胞是決定過繼性細胞治療效果的最關鍵因素；2)目前回輸的免疫細胞尤其是克隆化CD8+T細胞在體內難以長期存活，極大的影響了過繼性細胞治療的臨床療效。

記憶性T細胞在體內再次遭遇相同抗原時可迅速活化發揮免疫效應，同時具有自我更新能力,能夠提供更為長期的免疫保護，可能為過繼性細胞治療提供更為合適的免疫效應細胞。有望在回輸體內后建立更長期的抗腫瘤免疫。分離記憶性T細胞并通過TCR基因轉染有望提供具有更強生存能力和效應功能的腫瘤反應性T細胞。

發明內容

為了解決過繼性細胞治療技術中免疫細胞在體內難以長期存活，缺少靶向性的問題；本申請提供了一種從低溫凍存的外周血單個核細胞（PBMC）中分離純化記憶性T細胞（TCM），TCM誘導活化率高的誘導方法，然后將腫瘤特異TCR基因轉染自體TCM，使免疫細胞治療具有長效性和靶向性。

本發明是通過以下步驟得到的：

本發明利用低溫凍存技術保存人體外周血單個核細胞，預先儲存健康的免疫細胞，當日后患者需要治療時，復蘇并分離純化TCM，并誘導為殺傷性T細胞，腫瘤特異TCR基因轉染自體TCM，使免疫細胞治療具有靶向性。解決腫瘤患者記憶性T細胞增殖能力差和免疫無能的問題。

一種人體外周血單個核細胞低溫凍存與復蘇后記憶性T細胞分離純化、誘導活化和腫瘤特異TCR基因轉染自體TCM的方法，包括以下步驟：

健康人PBMC凍存復蘇，從中分離純化TCM，研究體外活化后，CIK細胞和TCM來源的效應T細胞（TE）細胞分化表型的差異。并以腫瘤抗原特異性TCR基因修飾CIK和TCM，明確TCR基因修飾CIK和TCM的抗腫瘤免疫功能。

1.CIK誘導：PBMC按照細胞密度(0.4-1.2)×10⁶/mL用X-VIVO15重懸，添加300-2000u/mLIFN-γ和50-100u/mL ATP誘導培養CIK細胞，第二天補加因子50-200u/mLIL-1α、500-2000u/mLIL-2、500-1000 u/mL IL-7、50-200ng/mLCD3單抗、50-200ng/mLCD28；此后每天觀察細胞生長狀態，每隔1-2天添加含有500-2000u/mLIL-2的X-VIVO15 培養基。

2.TCM的分選、刺激與基因轉染

(1)磁珠負性篩選CD8+T細胞，二次陽性分選TCM。

(2)協同刺激抗體/細胞因子初次刺激（培養后第1天）。以300-2000u/mLIFN-γ、抗人50-200ng/mL CD3單克隆抗體、50-200ng/mL CD28單克隆抗體及500-2000u/mL重組人IL-2和50-200u/mLIL-1α完成初次刺激。每2天半量換液，補加500-2000u/mL重組人IL-2、500-1000 u/mL IL-7 和500-1000 u/mL重組人IL-15。

（3）重組TCR腺病毒轉染（培養后第3天）CIK細胞及TCM細胞。