[發明專利]用于提高煙草黑脛病抗性的方法、特異性引物及試劑盒

有效

• 申請號: 201810916563.3
• 申請日: 2018-08-13
• 公開（公告）號: CN108913702B
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 宋雯雯;梁晨;段方猛;張玉瑩
• 申請（專利權）人: 青島農業大學;威海海洋職業學院
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 青島清泰聯信知識產權代理有限公司 37256
• 代理人: 李祺;張潔

本發明提出一種用于提高煙草黑脛病抗性的方法、特異性引物及試劑盒，屬于基因工程領域，提出了一種通過轉基因技術提高煙草對黑脛病抗性的方法。該技術方案包括通過轉基因技術獲得過量表達SoCYP85A1基因的轉基因煙草株系，利用所述轉基因煙草株系繼代培養獲得的穩定遺傳的抗性接種植株提高煙草對黑脛病的抗性。本發明利用轉基因技術得到穩定遺傳的抗性接種植株，提高了煙草體內防御酶的活性，增強了煙草對黑脛病的抗性，該方法不影響煙草的生長，并且提高了煙草的抗旱性和耐鹽性，大大降低了農藥的使用量，減少了對環境的污染。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，尤其涉及一種用于提高煙草黑脛病抗性的方法、特異性引物及試劑盒。

背景技術

煙草黑脛病是危害煙草生產的重要病害之一，在世界各產煙區普遍發生，也是危害我國煙葉生產的最主要病害。煙草黑脛病是土傳性的真菌病害，由于其發病率高、傳播快、難控制等特性，易對煙草生產造成嚴重經濟損失，因此，各產煙區對該病的防治高度重視。化學防治仍是煙草黑脛病的主要防治手段。但是，化學防治會造成農藥殘留、污染環境、影響健康等危害。因此，非常有必要培育出對環境友好的抗煙草黑脛病的優良抗性品種，以促進我國煙草產業的可持續發展。

目前，隨著分子生物學的發展，通過轉基因技術提高植物自身的抗病性已成為行之有效的手段，為煙草抗黑脛病的分子育種提供新的思路。眾多研究發現，油菜素甾醇(Brassinosteroids，BRs)在植物的生長發育和調控植物抵抗非生物脅迫方面發揮著重要的作用。CYP85A1基因編碼的酶是內源BRs合成的關鍵限速酶之一，作用于內源BRs生物合成中的C-20羥基化過程，過量表達該基因可以有效地調控內源BRs的生物合成量。然而，在煙草抗病分子研究過程中，關于內源BRs合成途徑的關鍵酶基因參與煙草抵抗黑脛病的研究尚未開展，有待于進一步研究。

發明內容

本發明提出一種用于提高煙草黑脛病抗性的方法、特異性引物及試劑盒，該方法可在不影響煙草生長并且提高抗逆性的前提下，增強煙草對黑脛病的抗性。

為了達到上述目的，本發明提出了一種用于提高煙草黑脛病抗性的方法，通過轉基因技術獲得過量表達SoCYP85A1基因的轉基因煙草株系，利用所述轉基因煙草株系繼代培養獲得的穩定遺傳的抗性接種植株提高煙草對黑脛病的抗性。

作為優選，所述過量表達SoCYP85A1基因的轉基因煙草株系由以下方法得到：

根據SoCYP90B1基因序列設計特異性引物，利用所述特異性引物擴增得到PCR產物，將所述PCR產物連接至植物表達載體pB7WG2D,1中，獲得含有目的基因的重組載體，將重組載體轉入農桿菌感受態細胞中，然后采用農桿菌介導的煙草葉盤方法將SoCYP85A1基因轉入煙草中，篩選再生植株，獲得過量表達SoCYP85A1基因的轉基因煙草株系。

作為優選，所述根據SoCYP90B1基因序列設計特異性引物具有如下序列：

上游引物(5’-3’)：ATGGCCGTTTTTATGGTGGTTTTTGCTGT

下游引物(5’-3’)：CTAATAACTCGAAACTCGAATGC。

作為優選，所述利用轉基因煙草株系繼代培養獲得的穩定遺傳的抗性接種植株具體包括：

將過量表達SoCYP85A1基因的轉基因煙草植株的T₀代植株進行繼代培養，每一代均進行目的基因、GFP基因和Bar基因的PCR檢測和GFP蛋白檢測，并保留陽性植株進行繼代培養，其中，T3代植株的PCR檢測和GFP蛋白檢測均呈陽性，可以進行穩定遺傳，因此，將T₃代植株中的L₃和L₅轉基因株系作為抗性接種植株。

作為優選，所述利用轉基因煙草株系繼代培養獲得的穩定遺傳的抗性接種植株提高煙草對黑脛病的抗性具體包括：