[發明專利]用于提高煙草黑脛病抗性的方法、特異性引物及試劑盒

有效

• 申請號: 201810916563.3
• 申請日: 2018-08-13
• 公開（公告）號: CN108913702B
• 公開（公告）日: 2020-07-31
• 發明（設計）人: 宋雯雯;梁晨;段方猛;張玉瑩
• 申請（專利權）人: 青島農業大學;威海海洋職業學院
• 主分類號: C12N15/52
• 分類號: C12N15/52;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/82
• 代理公司: 青島清泰聯信知識產權代理有限公司 37256
• 代理人: 李祺;張潔

1.一種用于提高煙草黑脛病抗性的方法，其特征在于，通過轉基因技術獲得過量表達SoCYP85A1基因的轉基因煙草株系，利用所述轉基因煙草株系繼代培養獲得的穩定遺傳的抗性接種植株提高煙草對黑脛病的抗性；

所述利用轉基因煙草株系繼代培養獲得的穩定遺傳的抗性接種植株提高煙草對黑脛病的抗性具體包括：

所述抗性接種植株在接種煙草黑脛病原菌后，抗性接種植株的SoCYP85A1基因表達量提高，生成由SoCYP85A1基因編碼的內源油菜素甾醇合成的關鍵限速酶，利用關鍵限速酶調控油菜素甾醇的生物合成量，通過提高煙草體內防御酶的活性來提高煙草對黑脛病的抗性。

2.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述過量表達SoCYP85A1基因的轉基因煙草株系由以下方法得到：

根據SoCYP85A1基因序列設計特異性引物，利用所述特異性引物擴增得到PCR產物，將所述PCR產物連接至植物表達載體pB7WG2D,1中，獲得含有目的基因的重組載體，將重組載體轉入農桿菌感受態細胞中，然后采用農桿菌介導的煙草葉盤方法將SoCYP85A1基因轉入煙草中，篩選再生植株，獲得過量表達SoCYP85A1基因的轉基因煙草株系。

3.根據權利要求2所述的方法，其特征在于，所述根據SoCYP90B1基因序列設計特異性引物具有如下序列：

上游引物(5’-3’)：ATGGCCGTTTTTATGGTGGTTTTTGCTGT

下游引物(5’-3’)：CTAATAACTCGAAACTCGAATGC。

4.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述利用轉基因煙草株系繼代培養獲得的穩定遺傳的抗性接種植株具體包括：

將過量表達SoCYP85A1基因的轉基因煙草植株的T₀代植株進行繼代培養，每一代均進行目的基因、GFP基因和Bar基因的PCR檢測和GFP蛋白檢測，并保留陽性植株進行繼代培養，其中，T3代植株的PCR檢測和GFP蛋白檢測均呈陽性，可以進行穩定遺傳，因此，將T₃代植株中的L₃和L₅轉基因株系作為抗性接種植株。

5.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗性接種植株接種煙草黑脛病原菌包括以下步驟：

對培養至7葉期的野生型煙草和抗性接種植株的莖基部注射接種煙草黑脛病原菌，光照培養箱中培養，觀察記錄發病情況。

6.根據權利要求1所述的方法，其特征在于，所述抗性接種植株的SoCYP85A1基因表達量通過以下方法測得：

取所述接種煙草黑脛病原菌前和接種4d后的抗性接種植株的葉片，提取RNA，以煙草Actin為內參基因，反轉錄合成cDNA模板，對多重PCR擴增反應的反應產物進行熒光檢測，采用2^–ΔΔCT法分析實驗結果，得到接種前后抗性接種植株的SoCYP85A1基因的表達量。