[發明專利]一種低免疫原性、可誘導凋亡的IPS細胞制備方法

在審

• 申請號: 201810916134.6
• 申請日: 2018-08-13
• 公開（公告）號: CN108998419A
• 公開（公告）日: 2018-12-14
• 發明（設計）人: 顧雨春;吳理達;尹樂;譚聲江
• 申請（專利權）人: 北京呈諾醫學科技有限公司
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/62;C12N15/85;C12N15/867
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 溫可睿;趙青朵

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及基因修飾的iPS細胞及其制備方法。本發明提供了敲除B2M基因且表達FKBP?Caspase9融合蛋白的iPS細胞，該iPS細胞的免疫原性較低，且可受控程序性凋亡。而由于進行的修飾是基因組級別的基因修飾，因此免疫原性的降低以及可受控程序性凋亡均可保持穩定性，并使分化獲得的細胞保持這一特點。免疫原性降低有益于異體回輸，可受控程序性凋亡提高了細胞的安全性，B2M基因敲除后，不能形成正常的MHCI，細胞免疫原性降低，此單克隆細胞株全部無B2M蛋白表達。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，尤其涉及基因修飾的iPS細胞及其制備方法。

背景技術

細胞治療(cell therapy)是利用正常或生物工程改造過的人體細胞，對組織、器官進行修復的治療方法。一般來講，細胞治療包括腫瘤細胞免疫治療，以及干細胞治療兩大類。目前，細胞治療在治療癌癥、血液病、心血管病、糖尿病、老年癡呆癥等方面顯示出越來越高的應用價值。

干細胞(stem cell)具有自我更新能力以及多向分化潛能，具有再生為各種組織器官和人體的潛力，雖然目前干細胞治療應用仍在探索階段，應用案例還較少，但干細胞治療擁有廣闊的前景，而且干細胞治療應用范圍很廣，例如：治療神經系統疾病、免疫系統疾病、替換受損細胞，組織，器官等。然而，干細胞制備成本較高，而且受年齡等因素影響，患者未必能夠及時、有效的獲得所需的干細胞。

iPS細胞，英文全稱為Induced pluripotent stem cells，中文全稱是誘導性多能干細胞，是由體細胞誘導而成的干細胞，具有和胚胎干細胞類似的發育多潛能性。iPS細胞的獲得方法相對簡單和穩定，不使用胚胎細胞或卵細胞，不僅在倫理上占有優勢，更擴大了干細胞的來源范圍，使更多患者能夠有機會利用iPS技術獲得所需的干細胞。另一方面，雖然iPS細胞在細胞治療中表現出優良的性能，但研究表明iPS細胞中的外源的誘導因子(Oct4，sox2，cMyc，klf4)的存在，增加了iPS在細胞治療中轉化為癌細胞的風險。因此，為了確保iPS細胞治療的安全，而降低iPS細胞的免疫原性、降低iPS細胞的腫瘤化風險，對干細胞異體移植具有重要意義。

發明內容

有鑒于此，本發明要解決的技術問題在于提供基因修飾的iPS細胞及其制備方法，該iPS細胞免疫原性低、可受控程序性凋亡。

本發明提供的基因修飾的iPS細胞，其表達FKBP-Caspase9融合蛋白，且不表達B2M蛋白。

本發明所述iPS細胞的制備方法，采用Cas9技術敲除iPS細胞的B2M基因；采用慢病毒感染法或定點敲入技術使iPS細胞表達FKBP-Caspase9融合蛋白。

本發明中，所述B2M基因的敲除采用含有SEQ ID NO.1所示序列的載體。

本發明中，所述FKBP-Caspase9融合蛋白表達基因的序列如SEQ ID NO.2所示。

本發明中，所述表達FKBP-Caspase9融合蛋白基因的慢病毒表達載體為pLenti-CMV/To-Neo。

本發明還提供了靶向敲除iPS細胞B2M基因的Cas9/gRNA載體，其含有SEQ ID NO.1所示的序列。

本發明還提供了FKBP-Caspase9融合蛋白的慢病毒表達載體，其含有SEQ ID NO.2所示的序列。

本發明所述的iPS細胞在制備用于細胞治療的產品中的應用。

本發明還提供了一種用于細胞治療的產品，其包含本發明所述的iPS細胞。

本發明還提供了一種低致瘤風險的細胞治療方法，其為：給予本發明所述的iPS細胞，當發生腫瘤化風險時給予AP1903。