[發明專利]ctDNA建庫試劑盒和建庫方法

在審

• 申請號: 201810914312.1
• 申請日: 2018-08-13
• 公開（公告）號: CN108977500A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 岳磊;宋禮華;楊楠;宋社吾;饒海軍;華曉君
• 申請（專利權）人: 安徽安科生物工程（集團）股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06
• 代理公司: 合肥誠興知識產權代理有限公司 34109
• 代理人: 湯茂盛

1.一種ctDNA建庫試劑盒，其特征在于，包括發卡接頭A、雙鏈接頭B和引物組；

所述發卡接頭A包括接頭A1和接頭A2，接頭A1和接頭A2的序列分別為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，且接頭A2的3′端用生物素修飾；

所述雙鏈接頭B包括接頭B1和接頭B2，接頭B1和接頭B2的序列分別為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

所述引物組包括擴增引物和接頭引物，擴增引物的序列號為SEQ ID NO.5，接頭引物的序列為SEQ ID NO.6-7。

2.根據權利要求1所述的ctDNA建庫試劑盒，其特征在于，還包括用于連接ctDNA和發卡接頭A或雙鏈接頭B的T4 DNA連接酶和用于T4 DNA連接酶的緩沖液。

3.一種ctDNA建庫的方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)提取游離ctDNA片段；

(2)對ctDNA片段進行去磷酸化與變性反應；

(3)將步驟(2)中的產物和T4 DNA連接酶、發卡接頭A混合進行接頭連接反應，并進行純化；

(4)將步驟(3)中的產物和引物混合進行退火和延伸反應，并進行純化；

(5)將步驟(4)中的產物和T4 DNA連接酶、雙鏈接頭B混合進行接頭連接反應，并進行純化、洗脫；

(6)將步驟(5)中的產物和接頭引物混合進行PCR擴增，得到ctDNA文庫。

4.根據權利要求3所述的ctDNA建庫的方法，其特征在于，還包括(7)對ctDNA文庫進行測序。

5.根據權利要求3所述的ctDNA建庫的方法，其特征在于，所述步驟(2)中的反應體系為：ctDNA 20μl，10×T4 RNA ligation buffer 8μl，2％Tween 2μl，Fast AP 1μl，滅菌水14.6μl；反應程序為：37℃10min，95℃2min。

6.根據權利要求3所述的ctDNA建庫的方法，其特征在于，所述步驟(3)中的反應體系為：PEG-8000(50％)32μl，發卡接頭A(10μM)1μl，T4 DNA ligase 1μl，100mM ATP 0.4μl；反應程序為：37℃1h，95℃1min。

7.根據權利要求3所述的ctDNA建庫的方法，其特征在于，所述步驟(4)中的反應體系為：滅菌水39.1μl，5×Klenow reaction buffer 5μl，dNTP mix(25mM each)0.4μl，Extension primer CL130(100μM)1μl，1％Tween-20 2.5μl。

8.根據權利要求3所述的ctDNA建庫的方法，其特征在于，所述步驟(5)中的反應體系為：滅菌水73.5μl，10×T4 DNA ligation buffer 10μl，PEG-4000(50％)10μl，Tween 20(1％)2.5μl，雙鏈接頭B 2μl。

9.根據權利要求3所述的ctDNA建庫的方法，其特征在于，所述步驟(6)中的反應體系為：滅菌水7.5μl，IS7 1μl，IS8 1μl，Libary 3μl，Mix 12.5μl；反應程序為：95℃預變性10min，95℃變性30s、60℃退火30s、72℃延伸30s、40個循環，72℃延伸5min。