[發明專利]ctDNA建庫試劑盒和建庫方法

在審

• 申請號: 201810914312.1
• 申請日: 2018-08-13
• 公開（公告）號: CN108977500A
• 公開（公告）日: 2018-12-11
• 發明（設計）人: 岳磊;宋禮華;楊楠;宋社吾;饒海軍;華曉君
• 申請（專利權）人: 安徽安科生物工程（集團）股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6806
• 分類號: C12Q1/6806;C40B50/06
• 代理公司: 合肥誠興知識產權代理有限公司 34109
• 代理人: 湯茂盛

本發明屬于分子基因學領域，具體涉及一種ctDNA建庫試劑盒和建庫方法；包括發卡接頭A、雙鏈接頭B和引物組；所述發卡接頭A包括接頭A1和接頭A2，接頭A1和接頭A2的序列分別為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，且接頭A2的3′端用生物素修飾；所述雙鏈接頭B包括接頭B1和接頭B2，接頭B1和接頭B2的序列分別為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；所述引物組包括擴增引物和接頭引物，擴增引物的序列號為SEQ ID NO.5，接頭引物的序列為SEQ ID NO.6?7；本發明提供的試劑盒靈敏度高，能提高ctDNA測序通量和測序準確性。

技術領域

本發明屬于分子基因學領域，具體涉及一種ctDNA建庫試劑盒和建庫方法。

背景技術

ctDNA，即循環腫瘤DNA，是體內循環腫瘤細胞和腫瘤組織在細胞代謝時留在血漿中的殘留物?？茖W研究發現，利用測序技術對ctDNA進行高通量分析，即可根據基因突變信息來指導抗腫瘤藥物選用、療效評估、預后判斷，甚至早期發現和早期診斷。然而，血漿中的ctDNA濃度極低，且多為小片段分子，提取困難，丟失量大，檢測靈敏度低，這為測序文庫的制備帶來了挑戰。目前市場上ctDNA建庫的方法是在雙鏈DNA末端補平加A，然后再加接頭進行擴增。然而，由于ctDNA的高度片段化特點，導致部分ctDNA無法補平加接頭，造成了ctDNA的損耗，使一些基因突變位點無法被檢測到，限制了檢測靈敏度。

申請號為CN201710116455.3的專利申請，試圖通過單鏈連接酶解連接接頭決上述問題，雖然提高了一定的檢測靈敏度，但是單鏈連接酶對單鏈DNA分子具有很強的環化作用，并且單鏈連接酶連接時對DNA單鏈末端存在堿基偏好性由強到弱依次為T>A>G>C，從而影響了檢測靈敏度，因此仍然需要更加行之有效的方案以彌補現有技術的不足。

發明內容

本發明的首要目的在于提供一種高靈敏性的ctDNA建庫的試劑盒。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：一種ctDNA建庫試劑盒，包括發卡接頭A、雙鏈接頭B和引物組；

所述發卡接頭A包括接頭A1和接頭A2，接頭A1和接頭A2的序列分別為SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2，且接頭A2的3′端用生物素修飾；

所述雙鏈接頭B包括接頭B1和接頭B2，接頭B1和接頭B2的序列分別為SEQ ID NO.3和SEQ ID NO.4；

所述引物組包括擴增引物和接頭引物，擴增引物的序列號為SEQ ID NO.5，接頭引物的序列為SEQ ID NO.6-7。

所述SEQ ID NO.1-7所示的引物如下表所示：

上述技術方案產生的有益效果在于：上述試劑盒提供了構建ctDNA文庫需要的接頭和特異性引物，可高效的制備用于illumina等測序平臺的ctDNA文庫，提高ctDNA測序通量和測序準確性。

本發明的另一個目的是利用上述試劑盒構建ctDNA文庫的方法，包括如下步驟：

(1)提取游離ctDNA片段；

(2)對ctDNA片段進行去磷酸化與變性反應；

(3)將步驟(2)中的產物和T4DNA連接酶、發卡接頭A混合進行接頭連接反應，并進行純化；

(4)將步驟(3)中的產物和引物混合進行退火和延伸反應，并進行純化；

(5)將步驟(4)中的產物和T4DNA連接酶、雙鏈接頭B混合進行接頭連接反應，并進行純化、洗脫；

(6)將步驟(5)中的產物和接頭引物混合進行PCR擴增，得到ctDNA文庫。