[發(fā)明專利]一種分離大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的方法在審
| 申請?zhí)枺?/td> | 201810913798.7 | 申請日： | 2018-08-13 |
| 公開（公告）號： | CN108913652A | 公開（公告）日： | 2018-11-30 |
| 發(fā)明（設(shè)計）人： | 趙成誠;黃祥宏;李娜 | 申請（專利權(quán)）人： | 武漢華聯(lián)科生物技術(shù)有限公司 |
| 主分類號： | C12N5/071 | 分類號： | C12N5/071 |
| 代理公司： | 北京天盾知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11421 | 代理人： | 楊本官 |
| 地址： | 430000 湖北省武漢市武昌區(qū)*** | 國省代碼： | 湖北;42 |
| 權(quán)利要求書： | 查看更多 | 說明書： | 查看更多 |
| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 腦微血管內(nèi)皮細胞 大鼠 細胞生物學(xué)領(lǐng)域 大鼠大腦皮質(zhì) 細胞成活率 細胞純度 細胞活力 原代分離 原代細胞 存活率 活力強 鼠齡 應(yīng)用 | ||
本發(fā)明屬于細胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種分離大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的方法。現(xiàn)階段常采用大鼠大腦皮質(zhì)直接進行原代分離，但由于鼠齡較大，細胞活力較弱，因此分離出來的細胞純度相對較低，同時活力也相對較差。本發(fā)明針對上述問題，提供一種方法簡單且細胞成活率高的分離大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的方法。本發(fā)明提供的一種分離大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的方法步驟簡單，更方便于實際應(yīng)用，且分離出的原代細胞活力強、純度高以及存活率高。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明屬于細胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種分離大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的方法。
背景技術(shù)
血腦脊液屏障(blood brain barrier，BBB)是機體的內(nèi)部屏障之一，由介于血循環(huán)與腦實質(zhì)間的軟腦膜、脈絡(luò)從的腦毛細血管壁和包于壁外的膠質(zhì)膜所組成，是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的中藥解剖結(jié)構(gòu)。腦脊液屏障主要是由腦微血管內(nèi)皮細胞和周細胞構(gòu)成，星形膠質(zhì)足突包繞毛細血管的外周，覆蓋其95％～99％的表面積，其中，血管內(nèi)皮細胞是構(gòu)成血腦脊液屏障的關(guān)鍵組織細胞位點，存在結(jié)構(gòu)復(fù)雜的緊密連接，且相對缺乏胞軟囊泡及窗孔，其能夠組織大多數(shù)內(nèi)外源性物質(zhì)透過學(xué)腦脊液屏障。
現(xiàn)階段常采用大鼠大腦皮質(zhì)直接進行原代分離，但由于鼠齡較大，細胞活力較弱，因此分離出來的細胞純度相對較低，同時活力也相對較差。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明針對上述問題，提供一種方法簡單且細胞成活率高的分離大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的方法。
本發(fā)明提供的一種分離大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的方法，包括以下步驟：
(1)將孕19～22天的大鼠胎鼠的全腦去除小腦、間腦、軟腦膜、腦膜大血管、大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜，之后將分離的大腦皮質(zhì)放置DMEM培養(yǎng)基中；
(2)將大腦皮質(zhì)剪成約0.5～1.5mm3大小組織塊，再加入等體積質(zhì)量分數(shù)為0.2～0.3％的胰蛋白酶和0.15～0.25％的膠原酶，混勻，在36.5～37.5℃下消化120～180min，每隔5～15min搖晃一次，之后加入4～6ml的含8～12％FBS的DMEM培養(yǎng)基，懸浮混勻后2500～3500r/min離心15～25min，再去除中上層神經(jīng)組織及大血管，保留底部沉淀；
(3)加入1.5～2.5ml的0.05～0.15％膠原酶/分散酶懸浮混勻后在36.5～37.5℃的水浴消化0.5～1.5h，之后離心去上清，再加1.5～2.5ml的DMEM培養(yǎng)基懸浮后鋪于經(jīng)離心形成連續(xù)梯度的10～14ml的45～55％Percoll，離心后吸取紅細胞層之上的純化的微血管段，吸出后用DMEM培養(yǎng)基漂洗1～3次；
(4)將收集的細胞用含8～12％FBS的DMEM培養(yǎng)基重懸，之后置于CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，24h后換液，以后隔天換液。
作為本發(fā)明的進一步優(yōu)化，步驟(1)中去除的間腦包括海馬；步驟(1)中去除軟腦膜及腦膜大血管采用將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動來吸除的方法；步驟(1)中去除大腦白質(zhì)、殘余大血管和軟腦膜采用細解剖鑷去除。
作為本發(fā)明的進一步優(yōu)化，步驟(3)中的膠原酶/分散酶包含20U/ml DNase I。
作為本發(fā)明的進一步優(yōu)化，步驟(3)中的消化后的離心是在室溫下1000r/min離心8分鐘。
作為本發(fā)明的進一步優(yōu)化，步驟(1)之前還包括細胞培養(yǎng)瓶的預(yù)處理步驟，如下：
將細胞培養(yǎng)瓶預(yù)先用100ug/ml的多聚賴氨酸包被，再用PBS潤洗3次，之后在超凈臺內(nèi)自然晾干。
本發(fā)明提供的一種分離大鼠腦微血管內(nèi)皮細胞的方法步驟簡單，更方便于實際應(yīng)用，且分離出的原代細胞活力強、純度高以及存活率高。
附圖說明
圖1是本發(fā)明分離出的細胞視圖；
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