[發明專利]一種分離大鼠腦微血管內皮細胞的方法

在審

• 申請號: 201810913798.7
• 申請日: 2018-08-13
• 公開（公告）號: CN108913652A
• 公開（公告）日: 2018-11-30
• 發明（設計）人: 趙成誠;黃祥宏;李娜
• 申請（專利權）人: 武漢華聯科生物技術有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071
• 代理公司: 北京天盾知識產權代理有限公司 11421
• 代理人: 楊本官

1.一種分離大鼠腦微血管內皮細胞的方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將孕19～22天的大鼠胎鼠的全腦去除小腦、間腦、軟腦膜、腦膜大血管、大腦白質、殘余大血管和軟腦膜，之后將分離的大腦皮質放置DMEM培養基中；

(2)將大腦皮質剪成約0.5～1.5mm3大小組織塊，再加入等體積質量分數為0.2～0.3％的胰蛋白酶和0.15～0.25％的膠原酶，混勻，在36.5～37.5℃下消化120～180min，每隔5～15min搖晃一次，之后加入4～6ml的含8～12％FBS的DMEM培養基，懸浮混勻后2500～3500r/min離心15～25min，再去除中上層神經組織及大血管，保留底部沉淀；

(3)加入1.5～2.5ml的0.05～0.15％膠原酶/分散酶懸浮混勻后在36.5～37.5℃的水浴消化0.5～1.5h，之后離心去上清，再加1.5～2.5ml的DMEM培養基懸浮后鋪于經離心形成連續梯度的10～14ml的45～55％Percoll，離心后吸取紅細胞層之上的純化的微血管段，吸出后用DMEM培養基漂洗1～3次；

(4)將收集的細胞用含8～12％FBS的DMEM培養基重懸，之后置于CO2培養箱培養，24h后換液，以后隔天換液。

2.根據權利要求1所述一種分離大鼠腦微血管內皮細胞的方法，其特征在于，步驟(1)中去除的間腦包括海馬；步驟(1)中去除軟腦膜及腦膜大血管采用將大腦半球在干濾紙上緩慢滾動來吸除的方法；步驟(1)中去除大腦白質、殘余大血管和軟腦膜采用細解剖鑷去除。

3.根據權利要求1所述一種分離大鼠腦微血管內皮細胞的方法，其特征在于，步驟(3)中的膠原酶/分散酶包含20U/ml DNase I。

4.根據權利要求1所述一種分離大鼠腦微血管內皮細胞的方法，其特征在于，步驟(3)中的消化后的離心是在室溫下1000r/min離心8分鐘。

5.根據權利要求1所述一種分離大鼠腦微血管內皮細胞的方法，其特征在于，步驟(1)之前還包括細胞培養瓶的預處理步驟，如下：

將細胞培養瓶預先用100ug/ml的多聚賴氨酸包被，再用PBS潤洗3次，之后在超凈臺內自然晾干。