[發明專利]一種脂肪間充質干細胞誘導分化為血管內皮細胞的方法

在審

• 申請號: 201810910346.3
• 申請日: 2018-08-10
• 公開（公告）號: CN109112094A
• 公開（公告）日: 2019-01-01
• 發明（設計）人: 朱建斌;江嘉豪;何美弟;陳熾峰;康斯敏;陳碧瑩;蔡祥勝;王明珠;王進輝
• 申請（專利權）人: 廣東唯泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12N5/071
• 分類號: C12N5/071;C12N5/0775;A61P15/10
• 代理公司: 廣州新諾專利商標事務所有限公司 44100
• 代理人: 許英偉

本發明提供了一種脂肪間充質干細胞誘導分化為血管內皮細胞的方法，包括以下步驟：將脂肪組織清洗干凈，加入與脂肪組織等體積的組織消化酶進行消化；消化結束后再加入與組織消化酶等體積的胰蛋白酶液進行消化；消化結束后離心去除上層油脂和消化液，沉淀為脂肪組織血管基質部分細胞；將血管基質部分細胞用生理鹽水再次重懸并篩去大塊組織，再用生理鹽水清洗，離心去除上清液，清洗后的血管基質細胞用無血清增殖培養基接種培養，得到脂肪間充質干細胞；選取P3代脂肪間充質干細胞消化得到單細胞懸液，用無血清增殖培養基接種培養過夜；培養24小時后去除無血清增殖培養基，添加誘導培養液誘導培養，得到分化后的血管內皮細胞。本方法可以誘導得到有效的血管內皮細胞。

技術領域

本發明屬于干細胞與再生醫學領域，具體涉及一種將脂肪間充質干細胞誘導為血管內皮細胞來治療糖尿病引發的勃起功能障礙(俗稱陽痿)的方法。

背景技術

男性勃起功能障礙(ED)是指陰莖持續不能達到和維持充分的勃起以獲得滿意的性生活，是威脅男性，尤其是老年男性健康生活質量的病癥之一，在老年人和糖尿病患者中發病率極高。

ED病因復雜，在上世紀70年代，研究人員還認為ED的發病與雄性激素減少，自然衰老以及心理因素有關。隨著研究的深入，人們發現ED與多種代謝性疾病(包括糖尿病、高血壓及心血管疾病)、藥物及外傷有關。男性正常勃起機制是陰莖海綿體平滑肌松弛，陰莖動脈擴張，動脈血流灌注增加和靜脈回流受阻等一套完整的血液動力學過程，在這一過程中，任何功能障礙的病因都可以導致ED。血管源性ED主要是糖尿病或心血管疾病引起的陰經海綿體動脈血流減少或靜脈回流閉合機制減弱造成的陰莖靜脈漏。

目前針對ED的首選藥物是磷酸二酯酶抑制劑(PDE5i)，俗稱“偉哥”。其作用機制是通過抑制磷酸二酯酶的活性提高血管平滑肌細胞內cAMP水平，增加鈣離子濃度，從而舒張動脈血管，促進陰經海綿體血流灌注。但是PDE5i只是對血管源性的ED具有比較明顯的療效，持續時間較短且價格昂貴。除此之外，對晚期糖尿病或前列腺癌根治手術引起的神經原性ED作用有限，受損神經組織中神經細胞和膠質細胞凋亡會產生無法逆轉的轉功能損傷，這些損傷是藥物無法治愈的。

糖尿病會引發陰莖海綿體動脈的粥樣斑塊形成，導致血流量減少，海綿體內的小動脈和竇狀隙內皮細胞的結構或功能破壞，影響勃起功能，導致疾病的發生。

血管內皮細胞是血管發生和修復的重要種子細胞，但是正常情況下外周血中血管內皮祖細胞數量稀少，健康成年人1ml外周血中CD34+的血管內皮細胞約1-3×10⁴，細胞來源十分有限，本發明通過分離成人脂肪間充質干細胞，體外誘導為血管內皮細胞，表達血管內皮細胞特異性標記物CD34和v-WF，將誘導后的血管內皮細胞植入2型糖尿病引發的勃起功能障礙大鼠陰莖根部，觀察其對勃起功能障礙的修復作用。

現有治療勃起功能障礙(ED)的藥物是俗稱“偉哥”的PDE5抑制劑，通過抑制血管內皮細胞磷酸二酯酶的活性提高血管平滑肌細胞內cAMP水平，增加鈣離子濃度，從而舒張動脈血管，促進陰經海綿體血流灌注。但是該藥只對血管源性的ED起作用，而糖尿病引發的ED患者陰莖海綿體內血管竇受損，粥樣斑塊形成，導致血流量減少，海綿體內的小動脈和竇狀隙內皮細胞的結構或功能破壞，影響勃起功能，此時傳統的PDE5i無明顯的治療效果。

發明內容

本發明的目的是針對以上要解決的技術問題，提供一種能夠有效使脂肪間充質干細胞誘導分化為血管內皮細胞的方法,并將誘導后的血管內皮細胞用于治療糖尿病引發的男性勃起功能障礙。

為此，本發明提供了以下技術方案。

一種脂肪間充質干細胞誘導分化為血管內皮細胞的方法，其包括以下步驟：

(1)將脂肪組織清洗干凈，加入與脂肪組織等體積的組織消化酶進行消化；

(2)消化結束后再加入與組織消化酶等體積的胰蛋白酶液進行消化；