[發明專利]一種選擇性殺滅肝癌細胞的新型溶瘤病毒及其構建方法

在審

• 申請號: 201810904522.2
• 申請日: 2018-08-09
• 公開（公告）號: CN109161562A
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發明（設計）人: 寧志豐;劉濱磊;劉復興;吳基良;武倩
• 申請（專利權）人: 湖北科技學院
• 主分類號: C12N15/869
• 分類號: C12N15/869;C12N15/66;C12N7/01;A61P35/00
• 代理公司: 武漢荊楚聯合知識產權代理有限公司 42215
• 代理人: 喻志勇

本發明公開了一種選擇性殺滅肝癌細胞的新型溶瘤病毒及其構建方法，通過將I型單純皰疹病毒17+株基因組上的ICP4基因啟動子置換成肝癌特異性啟動子、再將I型單純皰疹病毒17+株基因組上ICP34.5基因剔除并插入IL?12表達序列，得到HSV^AFP+IL?12。本發明提供了一種選擇性殺滅肝癌細胞的新型溶瘤病毒及其構建方法，該新型溶瘤病毒HSV^AFP+IL?12采用AFP啟動子及剔除ICP34.5的構建法實現高選擇性地在肝癌細胞內繁殖，確保該病毒不感染正常組織細胞；同時，插入IL?12表達序列增強該新型溶瘤病毒HSV^AFP+IL?12的免疫調節作用，確保受損的肝癌細胞被機體自身的免疫細胞徹底清除干凈。

技術領域

本發明涉及生物技術和基因治療領域，具體的說是涉及一種選擇性殺滅肝癌細胞的新型溶瘤病毒及其構建方法。

背景技術

溶瘤病毒療法是一種利用病毒特異性地在腫瘤細胞中復制繼而殺傷腫瘤細胞，并刺激機體產生特異性抗腫瘤免疫反應的新型腫瘤治療方法。相比其他腫瘤治療方法，溶瘤病毒療法具有復制高效、殺傷效果好和毒副作用小等特點，已經成為腫瘤治療研究領域的新熱點。

美國Amgen公司的Ⅰ型單純皰疹重組病毒T-VEC(talimogenelaherparepvec)在治療晚期黑色素瘤患者的Ⅲ期臨床試驗中顯示出良好的腫瘤治療效果，并成為首個獲得美國FDA批準上市的溶瘤病毒類治療藥物。溶瘤病毒在黑色素瘤治療上取得的成功引起了科學家對溶瘤病毒療法更廣泛的關注，溶瘤病毒的研究得到了進一步的推動。至今用于溶瘤治療的病毒高達數十種，包括Ⅰ型單純皰疹病毒(herpes simplex virustype 1，HSV-1)、腺病毒、呼腸孤病毒、新城疫病毒、脊髓灰質炎病毒、柯薩奇病毒、麻疹病毒、人類免疫缺陷病毒、腮腺炎病毒、牛痘病毒、水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)和流感病毒等。溶瘤病毒按發展歷程大致可分為4種類型：(1)野生型病毒株或自然減毒株，如新城疫病毒、柯薩奇病毒和呼腸孤病毒等；(2)基因工程選擇性減毒株，主要是刪除病毒某些關鍵基因而實現病毒復制的腫瘤選擇性，如ONYX-015、G207等；(3)基因加載型病毒株，主要是在前述兩種溶瘤病毒基礎上加載外源治療基因，如加載粒細胞巨噬細胞集落刺激因子(granulocyte macrophage colony stimulating factor，GM-CSF)的JX-594和T-VEC等；(4)轉錄靶向型病毒株，即在病毒必需基因前插入組織或腫瘤特異性啟動子來控制溶瘤病毒在腫瘤細胞內復制，如G92A等。

肝癌是一種常見惡性腫瘤。甲胎蛋白(Alpha fetoprotein，AFP)是一種主要在肝癌細胞表達的分泌性蛋白，本發明利用肝癌特異性表達AFP的特點構建選擇性在肝癌細胞感染繁殖的新型溶瘤病毒HSV^AFP+IL-12。該病毒不感染正常肝細胞及其它正常組織，可靜脈給藥，具有高效、特異性強等優點。對血液中的循環肝癌細胞及轉移性肝癌灶均有殺滅作用。

發明內容

為解決上述背景技術中提出的問題，本發明的目的在于提供一種選擇性殺滅肝癌細胞的新型溶瘤病毒及其構建方法。

為實現上述目的，本發明采取的技術方案為：

本發明公開了一種選擇性殺滅肝癌細胞的新型溶瘤病毒構建方法，包括以下步驟：

步驟一、構建pdICP4-promoter質粒：PCR分別擴增I型單純皰疹病毒17+株ICP4基因啟動子上游和下游的側翼序列后，用限制性內切酶EcoRI/SpeI分別消化后獲得ICP4基因啟動子的上游側翼序列、下游側翼序列及去除ICP4啟動子的I型單純皰疹病毒17+株，并用互補的連接酶Linker 1和Linker 2將所述ICP4基因啟動子的上游側翼序列和下游側翼序列連接起來，并把連接后的產物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位點創建質粒pdICP4-promoter；