[發(fā)明專利]一種選擇性殺滅肝癌細(xì)胞的新型溶瘤病毒及其構(gòu)建方法

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810904522.2
• 申請(qǐng)日: 2018-08-09
• 公開（公告）號(hào): CN109161562A
• 公開（公告）日: 2019-01-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 寧志豐;劉濱磊;劉復(fù)興;吳基良;武倩
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 湖北科技學(xué)院
• 主分類號(hào): C12N15/869
• 分類號(hào): C12N15/869;C12N15/66;C12N7/01;A61P35/00
• 代理公司: 武漢荊楚聯(lián)合知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 42215
• 代理人: 喻志勇

1.一種選擇性殺滅肝癌細(xì)胞的新型溶瘤病毒構(gòu)建方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一、構(gòu)建pdICP4-promoter質(zhì)粒：PCR分別擴(kuò)增I型單純皰疹病毒17+株ICP4基因啟動(dòng)子上游和下游的側(cè)翼序列后，用限制性內(nèi)切酶EcoRI/SpeI分別消化后獲得ICP4基因啟動(dòng)子的上游側(cè)翼序列、下游側(cè)翼序列及去除ICP4啟動(dòng)子的I型單純皰疹病毒17+株，并用互補(bǔ)的連接酶Linker 1和Linker 2將所述ICP4基因啟動(dòng)子的上游側(cè)翼序列和下游側(cè)翼序列連接起來(lái)，并把連接后的產(chǎn)物克隆到pBluescript的EcoRI和SalI酶切位點(diǎn)創(chuàng)建質(zhì)粒pdICP4-promoter；

步驟二、構(gòu)建pdICP4-AFP-promoter質(zhì)粒：用EcoRI/XhoI雙酶切消化的方式把由CMV啟動(dòng)子控制的人AFP啟動(dòng)子序列表達(dá)盒從質(zhì)粒pcDNA3.1-AFP-promoter中釋放出來(lái)，用T4DNA多聚酶處理后克隆入步驟一所得質(zhì)粒pdICP4-promoter的限制性內(nèi)切酶EcoHV酶切位點(diǎn)處，從而構(gòu)建質(zhì)粒pdICP4-AFP-promoter；

步驟三、BHK細(xì)胞內(nèi)同源重組I型單純皰疹病毒17+株：將步驟一中去除ICP4啟動(dòng)子的I型單純皰疹病毒17+株與步驟二中質(zhì)粒pdICP4-AFP-promoter共同轉(zhuǎn)染BHK細(xì)胞，使這兩者在BHK細(xì)胞發(fā)生同源重組，獲得表達(dá)AFP啟動(dòng)子的重組病毒載體17-d4-AFP-promoter；

步驟四、構(gòu)建pdICP34.5質(zhì)粒：PCR分別擴(kuò)增I型單純皰疹病毒17+株中ICP34.5基因的上游和下游側(cè)翼序列，得到的ICP34.5上游和下游側(cè)翼序列兩個(gè)片段用重疊PCR進(jìn)行連接，隨后把連接后的產(chǎn)物插入預(yù)先用限制性內(nèi)切酶BamHI/XhoI消化后的質(zhì)粒pSP72中，用T4DNA多聚酶補(bǔ)平質(zhì)粒的粘性末端，得到的質(zhì)粒命名為pdICP34.5；

步驟五、構(gòu)建質(zhì)粒pdICP34.5-hIL-12：用hIL-12基因替代質(zhì)粒pcDNA3.1-AFP-promoter中的AFP-promoter，產(chǎn)生質(zhì)粒pcDNA3.1-hIL-12；把來(lái)自質(zhì)粒pcDNA3.1-hIL-12中的hIL-12表達(dá)盒克隆入質(zhì)粒pdICP34.5的Afel位點(diǎn)處，創(chuàng)建質(zhì)粒pdICP34.5-hIL-12；

步驟六、步驟五中的質(zhì)粒pdICP34.5-hIL-12用來(lái)刪除步驟三中重組病毒載體17-d4-AFP-promoter中ICP34.5基因，從而構(gòu)建出溶瘤病毒HSV^AFP+IL-12。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種選擇性殺滅肝癌細(xì)胞的新型溶瘤病毒構(gòu)建方法，其特征在于，步驟一中的ICP4啟動(dòng)子中，

上游側(cè)翼序列的引物對(duì)包括：上游序列ICP4-promoterUSf為AAAAGAATTCGATACACATCGTTCAGACGGAGC；

下游序列ICP4-promoterUSr為AAAAACTAGTGATCGATCTCGCACATGGCCT；

下游側(cè)翼序列的引物對(duì)包括：上游序列ICP4-promoterDSf為AAAAAAGCTTTCACGCGCATGCTCTTCTC；

下游序列ICP4-promoterDSr為AAAACAGCTGCACCGTGCCCGTGATGAA。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種選擇性殺滅肝癌細(xì)胞的新型溶瘤病毒構(gòu)建方法，其特征在于，步驟四中的ICP34.5基因中，

上游側(cè)翼序列的引物對(duì)包括：上游序列ICP34.5USf為CTCTGACCTGAGATTGGCGGCACTG；

下游序列ICP34.5USr為GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCGCGGGCGCGTCCTGACCGCGGG；

下游側(cè)翼序列的引物對(duì)包括：上游序列ICP34.5DSf為GCGGCCGCAGCGCTGCGGCCGCCAGCGCGGCGGGGCCCGGCCAACCA；

下游序列ICP34.5DSr為TTCTTCCCTCTTCTCCCGCCCTCCA。