[發(fā)明專利]一種利用產(chǎn)毒海洋亞硫酸桿菌發(fā)酵制備石房蛤毒素的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810898501.4
• 申請日: 2018-08-08
• 公開（公告）號: CN109097415A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張曉玲;楊橋;穆軍;蔣志偉;張若男
• 申請（專利權(quán)）人: 浙江海洋大學(xué)
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務(wù)所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

本發(fā)明屬于海洋微生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用產(chǎn)毒海洋亞硫酸桿菌發(fā)酵制備石房蛤毒素的方法。所述的方法包括以下步驟：（1）菌株活化；（2）種子液的準(zhǔn)備；（3）發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵；（4）發(fā)酵液的提取；（5）粗提物的純化，即得石房蛤毒素。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn)：（1）本發(fā)明方法使用海洋微生物菌株亞硫酸桿菌Z1?D為生產(chǎn)菌種，該菌種發(fā)酵石房蛤毒素產(chǎn)率較高，可達(dá)61.5?72.8μg/L，其發(fā)酵時(shí)間為40?48小時(shí)，節(jié)省能耗；（2）本發(fā)明方法步驟簡單、工作量小，周期較短，所用試劑與材料均為微生物發(fā)酵試驗(yàn)常用試劑，對人體無害，對環(huán)境友好，成本低，具有較高的市場前景與經(jīng)濟(jì)價(jià)值。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于海洋微生物發(fā)酵領(lǐng)域，尤其是涉及一種利用產(chǎn)毒海洋亞硫酸桿菌發(fā)酵制備石房蛤毒素的方法。

背景技術(shù)

麻痹性貝類毒素（paralytic shellfish posoning，PSP）屬于胍胺類毒素，在已知赤潮毒素中毒性最強(qiáng)、分布最廣、威脅性最大、引發(fā)毒害事件最頻繁。主要包括石房蛤毒素（Saxitoxin，STX）及其衍生物，是典型的鈉離子通道阻斷劑。STX在有害赤潮檢測、神經(jīng)生物學(xué)、醫(yī)學(xué)診斷、藥物開發(fā)、生化戰(zhàn)劑等研究中均有重要應(yīng)用。在藥物開發(fā)方面，STX獨(dú)特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和毒理作用機(jī)制，成為研究細(xì)胞Na+通道的重要工具藥。其具有抗腫瘤、抗病毒、鎮(zhèn)痛、麻醉、解痙、降壓、止喘等多種功效。目前，石房蛤毒素的獲得主要通過甲藻藻株的規(guī)模培養(yǎng)及產(chǎn)物提取制備而來。該方法不僅培養(yǎng)周期長、成本高，且需要特殊的藻培養(yǎng)設(shè)備。與甲藻相比，海洋細(xì)菌具有基因組小、易培養(yǎng)、遺傳操作簡單等特性，因此，利用產(chǎn)毒海洋微生物菌株發(fā)酵與產(chǎn)物分離制備石房蛤毒素，是一條行之有效的替代方案。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明是為了克服現(xiàn)有技術(shù)中石房蛤毒素的獲得方法中培養(yǎng)周期長、成本高，且需要特殊的藻培養(yǎng)設(shè)備的問題，提供了一種具有產(chǎn)量高、周期短、成本低的一種利用產(chǎn)毒海洋亞硫酸桿菌發(fā)酵制備石房蛤毒素的方法。

本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種利用產(chǎn)毒海洋亞硫酸桿菌發(fā)酵制備石房蛤毒素的方法，所述的亞硫酸桿菌為亞硫酸桿菌（Sulfitobacter sp.）Z1-D 菌株，保藏編號為CCTCC AB 2016296，購買自中國典型培養(yǎng)物保藏中心，所述的方法包括以下步驟：

（1）菌株活化：將亞硫酸桿菌（Sulfitobacter sp.）Z1-D接種于斜面培養(yǎng)基中，培養(yǎng)活化菌株；

（2）種子液的準(zhǔn)備：挑取活化后的單菌落接種于種子罐中的液體種子培養(yǎng)基，擴(kuò)培菌株待用；

（3）發(fā)酵罐培養(yǎng)發(fā)酵：將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐中，將步驟（2）中的種子液接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵得到發(fā)酵液；

（4）發(fā)酵液的提取：將發(fā)酵液板框過濾，獲得菌體沉淀，用80%乙醇提取，合并提取液，旋蒸濃縮，得到粗提物；

（5）粗提物的純化：粗提物經(jīng)半制備色譜進(jìn)行梯度洗脫，收集石房蛤毒素組分，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑，獲得白色粉末，即得石房蛤毒素。

本發(fā)明中的石房蛤毒素采用海洋亞硫酸桿菌發(fā)酵法制備得到，其與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的步驟較為簡單，整體制備過程時(shí)間大大減少，有效的提高石房蛤毒素的制備效率與產(chǎn)量。因而能夠有效的合成石房蛤毒素，為研究石房蛤毒素的作用效果提供了有效的途徑。

作為優(yōu)選，所述的步驟（1）中平板培養(yǎng)基配方如下：硫酸銨0.8~1.2g、酵母膏0.2~0.5g、海藻酸鈉0.6~1.0g、磷酸鐵0.1~0.5g、瓊脂2g，加天然海水至100ml，pH6.9~7.3。

本發(fā)明中的亞硫酸桿菌（Sulfitobacter sp.）Z1-D為海洋細(xì)菌，因此在培養(yǎng)過程中需加入一定量的天然海水，以促進(jìn)其活性。