[發明專利]一種利用產毒海洋亞硫酸桿菌發酵制備石房蛤毒素的方法

在審

• 申請號: 201810898501.4
• 申請日: 2018-08-08
• 公開（公告）號: CN109097415A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發明（設計）人: 張曉玲;楊橋;穆軍;蔣志偉;張若男
• 申請（專利權）人: 浙江海洋大學
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12R1/01
• 代理公司: 杭州杭誠專利事務所有限公司 33109
• 代理人: 尉偉敏

1.一種利用產毒海洋亞硫酸桿菌發酵制備石房蛤毒素的方法，所述的亞硫酸桿菌為亞硫酸桿菌（Sulfitobacter sp.）Z1-D 菌株，保藏編號為CCTCC AB 2016296，購買自中國典型培養物保藏中心，其特征在于，所述的方法包括以下步驟：

（1）菌株活化：將亞硫酸桿菌（Sulfitobacter sp.）Z1-D接種于斜面培養基中，培養活化菌株；

（2）種子液的準備：挑取活化后的單菌落接種于種子罐中的液體種子培養基，擴培菌株待用；

（3）發酵罐培養發酵：將發酵培養基裝入發酵罐中，將步驟（2）中的種子液接入發酵培養基中，發酵得到發酵液；

（4）發酵液的提取：將發酵液板框過濾，獲得菌體沉淀，用80%乙醇提取，合并提取液，旋蒸濃縮，得到粗提物；

（5）粗提物的純化：粗提物經半制備色譜進行梯度洗脫，收集石房蛤毒素組分，旋轉蒸發溶劑，獲得白色粉末，即得石房蛤毒素。

2.根據權利要求1所述的一種利用產毒海洋亞硫酸桿菌發酵制備石房蛤毒素的方法，其特征在于，所述的步驟（1）中平板培養基配方如下：硫酸銨0.8~1.2g、酵母膏0.2~0.5g、海藻酸鈉0.6~1.0g、磷酸鐵0.1~0.5g、瓊脂2g，加天然海水至100ml，pH6.9~7.3。

3.根據權利要求1或2所述的一種利用產毒海洋亞硫酸桿菌發酵制備石房蛤毒素的方法，其特征在于，所述的步驟（1）中培養溫度為27~31℃，培養時間為2~4天。

4.根據權利要求1所述的一種利用產毒海洋亞硫酸桿菌發酵制備石房蛤毒素的方法，其特征在于，所述的步驟（2）中液體種子培養基配方如下：酵母膏5 g、蛋白胨4 g、葡萄糖1g、天然海水1000 mL，pH 6.2~7.1。

5.根據權利要求1或4所述的一種利用產毒海洋亞硫酸桿菌發酵制備石房蛤毒素的方法，其特征在于，所述的步驟（2）中種子罐中的通氣量為40-50 L/min，攪拌轉速160-180轉/min，28℃培養16小時，待種子液的OD600 達到0.6 ~0.8，光鏡觀察菌體生長良好，無雜菌污染時待用。

6.根據權利要求1所述的一種利用產毒海洋亞硫酸桿菌發酵制備石房蛤毒素的方法，其特征在于，所述的步驟（3）中發酵培養基的配方如下：酵母膏10 g、蛋白胨6 g、葡萄糖4g、精氨酸0.015 g、氯化鈣0.002 g以及天然海水1000 mL ，pH 6.3~7.0。

7.根據權利要求1所述的一種利用產毒海洋亞硫酸桿菌發酵制備石房蛤毒素的方法，其特征在于，所述的步驟（3）中發酵培養基的裝入量為發酵罐裝液量體積百分比的35~50%，種子液按體積百分比2.5%~3.5% 的接種量接入發酵培養基中。

8.根據權利要求1或7所述的一種利用產毒海洋亞硫酸桿菌發酵制備石房蛤毒素的方法，其特征在于，所述的步驟（3）中發酵罐為平葉渦輪攪拌型發酵罐，發酵過程中保持罐壓0.12~0.18MPa，攪拌速率為140~160r/min，控制通氣量40~60 L/min，發酵溫度為27~30℃，發酵時間為40~48小時。

9.根據權利要求1所述的一種利用產毒海洋亞硫酸桿菌發酵制備石房蛤毒素的方法，其特征在于，所述的步驟（4）中80%乙醇的pH 為2.0~4.0，提取次數為3次。

10.根據權利要求1所述的一種利用產毒海洋亞硫酸桿菌發酵制備石房蛤毒素的方法，其特征在于，所述的石房蛤毒素產率為61.5~72.8 μg/L。