[發(fā)明專利]強(qiáng)化yugT表達(dá)的地衣芽孢桿菌DW2-yugT的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810897429.3
• 申請(qǐng)日: 2018-08-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108865965B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳守文;蔡冬波;吳非;李俊輝;陳曉斌;樓麗君;邱湘琪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 綠康生化股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/56;C12P21/04;C12R1/10
• 代理公司: 福州鼎新知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35263
• 代理人: 李向楠;楊慧娟

本發(fā)明提供一種強(qiáng)化yugT表達(dá)的地衣芽孢桿菌DW2?yugT的應(yīng)用，本發(fā)明通過(guò)基因工程的方法在地衣芽孢桿菌DW2的基因組內(nèi)插入葡萄糖苷酶YugT的基因—yugT，達(dá)到了強(qiáng)化葡萄糖苷酶YugT表達(dá)的目的。相對(duì)于地衣芽胞桿菌DW2來(lái)說(shuō)，本發(fā)明所構(gòu)建得到的菌株在桿菌肽發(fā)酵過(guò)程中發(fā)酵液中桿菌肽的產(chǎn)量提高了18%以上。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程菌改造技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一種強(qiáng)化葡萄糖苷酶YugT表達(dá)的地衣芽胞桿菌菌株及制備方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)

地衣芽胞桿菌是公認(rèn)的具有生物安全性（GRAS）的重要工業(yè)微生物菌株，其廣泛存在于自然界中，其屬于革蘭氏陽(yáng)性菌。目前，由于地衣芽胞桿菌具有遺傳背景清晰、培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、工業(yè)應(yīng)用價(jià)值高等特點(diǎn)，因此近年來(lái)被廣泛研究。目前，地衣芽胞桿菌被主要用來(lái)生產(chǎn)聚γ-谷氨酸、桿菌肽、乙偶姻、2,3-丁二醇、地衣素及各種酶制劑等生物化工產(chǎn)品。與此同時(shí)，其也可以作為良好的異源蛋白表達(dá)宿主菌，從而應(yīng)用于異源蛋白的表達(dá)。

桿菌肽是一類由12個(gè)氨基酸殘基組成的環(huán)肽類抗生素，其氨基酸包括鳥(niǎo)氨酸（Orn），D-苯丙氨酸（D-Phe），異亮組氨酸（His）, D-天冬氨酸（D-Asp）, 天冬酰胺（Asn）、 賴氨酸（Lys）, D-谷氨酸（D-Glu），半胱氨酸（Cys），亮氨酸（Leu），異亮氨酸（Ile） 和纈氨酸（Val）11種氨基酸。桿菌肽可以抑制或殺滅某些致病菌，強(qiáng)烈抑制革蘭氏陰性菌的生長(zhǎng)，并與其它抗生素（如青霉素、慶大霉素等）具有協(xié)同增強(qiáng)效應(yīng)；并且，其幾乎不會(huì)在動(dòng)物的腸道內(nèi)被吸收，而且排泄迅速，沒(méi)有殘留，因此被廣泛應(yīng)用于飼料添加。

地衣芽胞桿菌中存在著眾多與菌株代謝產(chǎn)物的合成息息相關(guān)的基因，而，桿菌肽的產(chǎn)量與何種基因相關(guān)仍然是個(gè)未知數(shù)，通過(guò)何種基因改造的方式得到高產(chǎn)桿菌肽的工程菌也有待進(jìn)一步的研究。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的之一在于提供一種強(qiáng)化葡萄糖苷酶YugT表達(dá)的地衣芽胞桿菌菌株（Bacillus licheniformis）的制備方法，此構(gòu)建方法通過(guò)在地衣芽胞桿菌的基因組內(nèi)插入葡萄糖苷酶YugT的基因—yugT，達(dá)到了強(qiáng)化葡萄糖苷酶YugT表達(dá)的目的。

強(qiáng)化YugT表達(dá)的地衣芽胞桿菌菌株的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

（1）以地衣芽胞桿菌DW2的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出yugT基因片段，再在yugT基因片段上游連接P43啟動(dòng)子、下游連接淀粉酶終止子，構(gòu)成完整的yugT表達(dá)元件；

（2）同時(shí)，以地衣芽胞桿菌DW2的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出yugT基因的上游同源臂和yugT基因的下游同源臂；

（3）通過(guò)重疊延伸PCR將步驟（2）得到的yugT基因的上游同源臂、步驟（1）得到的yugT表達(dá)元件和步驟（2）得到的yugT基因的下游同源臂連接到一起，構(gòu)成目的基因片段，該目的基因片段的排列順序?yàn)椋?Italic>yugT基因的上游同源臂-yugT表達(dá)元件-yugT基因的下游同源臂；

（4）采用BamHI和 XbaI限制性內(nèi)切酶對(duì)步驟（3）得到的目的基因片段進(jìn)行雙酶切得到酶切基因片段；

（5）準(zhǔn)備質(zhì)粒 T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒 T2(2)-ori進(jìn)行雙酶切得到線性質(zhì)粒片段；