[發(fā)明專利]強(qiáng)化yugT表達(dá)的地衣芽孢桿菌DW2-yugT的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810897429.3
• 申請(qǐng)日: 2018-08-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108865965B
• 公開(kāi)（公告）日: 2021-03-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳守文;蔡冬波;吳非;李俊輝;陳曉斌;樓麗君;邱湘琪
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 綠康生化股份有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/56;C12P21/04;C12R1/10
• 代理公司: 福州鼎新知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 35263
• 代理人: 李向楠;楊慧娟

1.強(qiáng)化yugT表達(dá)的地衣芽孢桿菌（ Bacillus licheniformis） DW2-yugT的應(yīng)用，其特征在于，所述地衣芽孢桿菌DW2-yugT應(yīng)用于桿菌肽生產(chǎn)中，所述地衣芽孢桿菌DW2-yugT的構(gòu)建方法，包括以下步驟：

（1）以地衣芽孢 桿菌DW2的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出yugT基因片段，再在yugT基因片段上游連接P43啟動(dòng)子、下游連接淀粉酶終止子，構(gòu)成完整的yugT表達(dá)元件；

（2）同時(shí)，以地衣芽孢 桿菌DW2的基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增出yugT基因的上游同源臂和yugT基因的下游同源臂；

（3）通過(guò)重疊延伸PCR將步驟（2）得到的yugT基因的上游同源臂、步驟（1）得到的yugT表達(dá)元件和步驟（2）得到的yugT基因的下游同源臂連接到一起，構(gòu)成目的基因片段，該目的基因片段的排列順序?yàn)椋?Italic>yugT基因的上游同源臂-yugT表達(dá)元件-yugT基因的下游同源臂；

（4）采用BamHI和XbaI限制性內(nèi)切酶對(duì)步驟（3）得到的目的基因片段進(jìn)行雙酶切得到酶切基因片段；

（5）準(zhǔn)備質(zhì)粒 T2(2)-ori，并采用BamHI和XbaI限制性內(nèi)切酶對(duì)質(zhì)粒 T2(2)-ori進(jìn)行雙酶切得到線性質(zhì)粒片段；

（6）將步驟（4）得到的酶切基因片段和步驟（5）得到的線性質(zhì)粒片段經(jīng) DNA連接酶進(jìn)行連接，得到整合質(zhì)粒T2(2)-yugT；

（7）將步驟（6）得到的整合質(zhì)粒T2(2)-yugT轉(zhuǎn)入地衣芽孢 桿菌DW2中，以卡那青霉素抗性作為篩選標(biāo)記，篩選得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，并抽質(zhì)粒進(jìn)行菌落PCR驗(yàn)證，將驗(yàn)證成功的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子在45℃條件下轉(zhuǎn)接培養(yǎng)數(shù)次后，進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)，得到yugT基因的上游同源臂或yugT基因的下游同源臂與地衣芽孢 桿菌DW2基因組DNA產(chǎn)生單交換的陽(yáng)性單交換結(jié)合子菌株；

（8）挑選yugT基因的上游同源臂與地衣芽孢 桿菌DW2基因組DNA產(chǎn)生單交換的陽(yáng)性單交換結(jié)合子菌株與yugT基因的下游同源臂與地衣芽孢 桿菌DW2基因組DNA產(chǎn)生單交換的陽(yáng)性單交換結(jié)合子菌株混合接種于37℃、不含有卡那青霉素的培養(yǎng)基中經(jīng)過(guò)數(shù)次轉(zhuǎn)接培養(yǎng)，再經(jīng)PCR法篩選得到整合了yugT基因的地衣芽孢 桿菌DW2-yugT；

其中，所述的地衣芽孢 桿菌DW2已于2011年10月12日保藏于位于武漢的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為CCTCC NO：M2011344；

所述地衣芽孢 桿菌DW2的基因組DNA序列中的yugT基因如 SEQ ID NO.1 所示。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的強(qiáng)化yugT表達(dá)的地衣芽孢桿菌DW2-yugT的應(yīng)用，其特征在于，該應(yīng)用步驟包括： A種子發(fā)酵，B生產(chǎn)發(fā)酵。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的強(qiáng)化yugT表達(dá)的地衣芽孢桿菌DW2-yugT的應(yīng)用，其特征在于，所述種子發(fā)酵的培養(yǎng)基配方為：6-10g/L蛋白胨，2-6g/L酵母浸出粉，6-10g/L氯化鈉，pH7.0 ~ 7.2。

4.根據(jù)權(quán)利要求2所述的強(qiáng)化yugT表達(dá)的地衣芽孢桿菌DW2-yugT的應(yīng)用，其特征在于，所述生產(chǎn)發(fā)酵的培養(yǎng)基配方為：60-100g/L豆粕；15-40g/L玉米淀粉；4-8g/LCaCO₃和0.5-2g/L (NH₄)₂SO₄。