[發(fā)明專利]一種調(diào)控茶樹茸毛形成的方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810897239.1
• 申請日: 2018-08-08
• 公開（公告）號: CN109097370A
• 公開（公告）日: 2018-12-28
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 孫彬妹;肖熙;劉任堅;代風(fēng)玲;劉少群
• 申請（專利權(quán)）人: 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號: C12N15/29
• 分類號: C12N15/29;C12N15/82;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 廣州市時代知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 44438
• 代理人: 盧浩

1.一種調(diào)控茶樹茸毛形成的方法，其特征在于，包括以下步驟：

S1. 對轉(zhuǎn)錄因子CsTTG1進行生物信息學(xué)分析，構(gòu)建進化樹;

S2. 將目標(biāo)基因CsTTG1與載體質(zhì)粒pBI121 重組，構(gòu)建了茶樹CsTTG1基因的過表達載體PBI121- CsTTG1 ;

S3. 將過表達載體PBI121- CsTTG1并轉(zhuǎn)導(dǎo)農(nóng)桿菌GV1301中；

S4. 在農(nóng)桿菌GV1301介導(dǎo)下，過表達載體pBI121- CsTTG1轉(zhuǎn)導(dǎo)到具有與轉(zhuǎn)錄因子CsTTG1同源性因子的茶樹作物中。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)控茶樹茸毛形成的方法，其特征在于，還包括步驟S5，具體為通過篩選培養(yǎng)基后、生根并移栽下地，提取上述茶樹作物的DNA，進行PCR檢測，同時進行利用熒光定量PCR分析，驗證結(jié)果質(zhì)粒pBI121- CsTTG1已成功轉(zhuǎn)入。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)控茶樹茸毛形成的方法，其特征在于，所述進化樹如下式所示：

。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)控茶樹茸毛形成的方法，其特征在于，步驟S2中，過表達載體PBI121- CsTTG1的構(gòu)建方法包括：

將增加A尾CsTTG1目的片段與pBI121質(zhì)粒載體采用T4-DNA ligase進行連接，其中，連接體系為：按照目的片段：載體片段為5-2:1的比例加入總反應(yīng)體系為15-30ul中，具體如下： CsTTG1目的片段250-60ng，pBI121質(zhì)粒載體50-30ng，T4-DNA ligase 0.2-0.7ul, T4-DNA ligase Buffer 1-4ul，補無菌水ddH₂O至15-30ul，移液槍輕輕吸打混勻，放在PCR儀中，16℃連接過夜。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的調(diào)控茶樹茸毛形成的方法，其特征在于，步驟S3中包括以下具體操作：制備連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)、質(zhì)粒 DNA 提取、農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)的制備、重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的調(diào)控茶樹茸毛形成的方法，其特征在于，所述連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)包括以下步驟：

（1）將大腸桿菌DH5α菌種，于冰上完全解凍后輕輕將細(xì)胞懸??；

（2）加入5ul連接產(chǎn)物混勻后，置于冰上30min；

（3）提前開好42℃水浴鍋，將離心管放水浴鍋中90s，迅速轉(zhuǎn)移至冰上，冰浴2min；

（4）加入800ul新鮮的LB液體培養(yǎng)基，37℃搖床培養(yǎng)1h；

（5）以8000rmp離心2min，加入新鮮的100ul LB培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞；

（6）將適量菌液涂布于含有相應(yīng)抗生素的平板上，37℃培養(yǎng)12-16h；

（7）恒溫箱中培養(yǎng)12-16 h，用接種針從平板上挑取一個單菌落，接種到含有10mL液體LB培養(yǎng)50ml三角瓶中，37℃搖床內(nèi)，200 rpm振蕩培養(yǎng)10-12 h；

所述液體LB包含0.5-3%蛋白胨，0.2-0.7%酵母提取物，0.7-1.6%氯化鈉，所述液體LB的pH為6.5-7.8。