[發明專利]一種利用GEM純化包涵體的方法

在審

• 申請號: 201810897135.0
• 申請日: 2018-08-08
• 公開（公告）號: CN109180818A
• 公開（公告）日: 2019-01-11
• 發明（設計）人: 周志江;趙芳坤;杜仁鵬;韓燁;肖華志;宋巧智;曹碩
• 申請（專利權）人: 天津大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/14;C12N15/70
• 代理公司: 天津市北洋有限責任專利代理事務所 12201
• 代理人: 琪琛

本發明公開了一種利用GEM純化包涵體的方法，構建重組蛋白與AcmA融合蛋白表達載體，誘導表達得到重組蛋白大部分以包涵體形式存在，利用8M尿素溶解包涵體，利用GEM將溶解的重組蛋白從尿素中吸附分離，然后進行復性。該方法可以利用簡單易得的GEM從尿素溶解的包涵體中分離純化帶有AcmA的重組蛋白，并且具有良好的蛋白回收效率，同時可以簡化包涵體復性過程，簡化操作，降低酶活損失。

技術領域

本發明涉及一種利用GEM純化包涵體的方法。

背景技術

大腸桿菌是最常用的一種重組表達宿主，其具有生長速度快、遺傳背景清晰、存在大量操作工具等優點。將pET質粒轉入大腸桿菌，利用IPTG誘導進行異源蛋白重組表達是異源表達方面的主流方法。但是大腸桿菌作為表達宿主也存在一些不可避免的缺點，如包涵體形成、缺乏表達后修飾能力等，其中包涵體的形成是最常見、最不可避免的一種現象。包涵體的形成主要是由于大腸桿菌大量表達異源蛋白，部分蛋白無法正確折疊，通過降低誘導溫度、降低IPTG的濃度均可以降低包涵體的形成，但是仍不能避免包涵體的形成。包涵體具有正確的一級結構，但是高級結構不正確，導致其不可溶并且沒有生物活性。利用變性劑如8M尿素可以將包涵體充分溶解變性，然后再進行復性，可以使不具有酶活的包涵體重新具有全部或部分生物活性。傳統的包涵體變性復性過程需要較長的時間，同時需要多步操作。

乳酸乳球菌是一種安全級別(GRAS)的菌。乳酸乳球菌的肽聚糖水解酶AcmA的C端的蛋白錨定域可以特異的結合到乳酸乳球菌的細胞壁上，利用這個特性，通過酸煮沸手段去除乳酸乳球菌中大部分蛋白和DNA，得到了無生命的革蘭氏陽性基質(Gram-positiveenhancer matrix particles，GEM)。將蛋白與AcmA的重組融合，其可以特異的結合到GEM上。GEM錨定AcmA融合蛋白具有以下特點：具有良好的生物安全性、具有良好的機械性能和具有良好的蛋白特異結合能力。GEM具有將帶有AcmA標簽重組蛋白從尿素中結合分離的能力。

發明內容

為了解決現有技術中存在的問題，本發明提供一種利用GEM純化包涵體的方法，克服現有技術中包涵體變性復性過程需要較長的時間，同時需要多步操作的問題。

本發明的技術方案是：一種利用GEM純化包涵體的方法，按以下步驟進行：

1)構建重組蛋白-AcmA融合表達載體，轉入大腸桿菌BL21；

2)利用IPTG進行誘導表達；

3)制備GEM；

4)誘導表達產物破碎后，上清與GEM混勻結合，離心分離；

5)8M尿素溶解包涵體；

6)GEM從尿素溶解的包涵體中純化分離重組蛋白；

7)包涵體的復性；

8)酶活測定。

在步驟1)中，以乳酸乳球菌NZ9000基因組為模板，擴增得到AcmA(GenBank:ADJ59253.1)錨定區片段，連接到pET28a上得到錨定質粒pET28a-AcmA，以解淀粉芽孢桿菌BH072基因組為模板，擴增得到α-淀粉酶(GenBank:AJE77362.1)的基因片段，連接到質粒pET28a-AcmA上，得到重組表達質粒pET28a-α-amylase-AcmA，通過化學轉化轉入大腸桿菌表達載體BL21。

在步驟2)中，劃線分離得到帶有質粒的BL21的單克隆，過夜培養得到種子液，以1％-5％的接種量接種，當菌液OD₆₀₀達到0.6-0.9時加入IPTG進行誘導，誘導濃度為0.5mM-2mM，誘導溫度選擇為37℃，誘導時間為18小時-24小時，所有培養基為添加50μg/mL卡那霉素的LB培養基。